ГОСТ 26075-2013
10.3.4 Внесение антирабического пероксидазного конъюгата
В лунки планшета вносят антирабический пероксидазный конъюгат в рабочем разведении, по
сле чего накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37 ± 0,5) °С в течение 1 ч.
Затем лунки планшета трехкратно отмывают, как описано в 10.3.2.
10.3.5 Внесение субстратной смеси
Для проявления реакции в лунки планшета вносят готовую субстратную смесь. Реакцию про
являют в течение 15-30 мин при температуре (22 ± 0,5) °С в темноте. Реакцию останавливают до
бавлением раствора серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм3.
10.4 Обработка результатов
Учет реакции проводят визуально или на сканирующем спектрофотометре в соответствии с
инструкцией по применению набора.
Если в субстратной смеси в качестве хромогена используют ОФД, то измерение оптической
плотности проводят при 490 нм, если используют ТМБ, то при 450 нм.
Реакцию учитывают только в том случае, если в лунках с контрольным отрицательным анти
геном специфическое окрашивание отсутствует при интенсивном окрашивании в лунках с контроль
ным положительным антигеном. При визуальном учете пробу считают положительной, если хотя бы в
одном (первом) разведении наблюдается специфическое окрашивание.
При спектрофотометрическом учете результата ИФА проводят расчет коэффициента специ
фичности КСП1который равен отношению оптической плотности (ОП) продукта реакции в лунках с кон
трольным положительным антигеном или исследуемым материалом (ОП^ к оптической плотности
субстратной смеси в лунках с контрольным отрицательным антигеном (ОП2). Реакцию считают поло
жительной, если коэффициент специфичности Кспболее 2,1 и отрицательной, если менее 2,1.
Пример
ОП1
=
0,641, ОП2
=
0,120, Ксп= 5,34- реакция положительная или OHi = 0,180, ОП2
=
0,120
Ксп=1,5 —реакция отрицательная.
В случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат
должен быть подтвержден другими методами по 7 - 9.
11 Реакция диффузионной преципитации (РДП)
11.1 Сущность метода
Сущность метода РДП заключается в способности антител и вирусного антигена диффунди
ровать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс «антиген-
антитело», наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.
11.2 Подготовка к исследованию
11.2.1 Подготовка проб
Подготовка проб к исследованию - по 8.2.1.
Для исследования допускаются несвежие пробы мозга животных, контаминированные бакте
риальной микрофлорой.
11.2.2 Подготовка агара
Для приготовления агара смешивают 1,5 г агара «Дифко», 1 см31 %-ного раствора метилово
го оранжевого в 50 %-ном этиловом спирте, 0,01 г мертиолята, 100 см3изотонического раствора на
трия хлорида. Полученную смесь кипятят до полного расплавления агара, разливают по
пробиркам, автоклавируют при давлении 0,5 атм в течение 30 мин ихранят в холодильнике при
температуре 4 °С.
11.2.3 Подготовка предметных стекол (чашек Петри)
Реакцию ставят либо на предметных стеклах, либо на чашках Петри. На обезжиренное стек
ло наносят каплю расплавленного агара, равномерно распределяют ее по стеклу и оставляют при
комнатной температуре на 20 - 30 мин для застывания агара. Затем наносят на стекло 2,5 см3рас
плавленного агара, образуя слой толщиной около 2 мм, и оставляют на 20 - 30 мин. В застывшем
слое агара с помощью специального штампа или металлической тонкостенной трубочки диаметром 4 -
5 мм делают лунки. Столбики агара осторожно извлекают, не повреждая и не допуская отслаивания
от стекла тонкого слоя агарового геля, с помощью глазного пинцета или другого инструмента.
Чашки Петри готовят аналогично, внося в них 10-15 см3расплавленного агара для получе
ния слоя толщиной 2 - 3 мм.
11.3 Проведение исследования
Непосредственно перед постановкой реакции готовят разведения антирабической сыворотки
(иммуноглобулина), для чего в четыре пробирки вносят по 1,0 см3 изотонического раствора натрия
хлорида. В первую пробирку добавляют 1,0 см3антирабической сыворотки, получая разведение 1 : 2,
8