ГОСТ 26075-2013
9.2 Подготовка проб к исследованию - по 8.2.1.
9.3 Проведение исследования
Пять - шесть белых мышей заражают 10 %-ной суспензией патологического материала ин-
трацеребрально в объеме 0,02 - 0,03 см3. Зараженных мышей помещают в отдельную клетку, на ко
торую наклеивают этикетку с указанием даты заражения, количества мышей, способа заражения и
номера экспертизы патологического материала. Наблюдение за животными проводят не менее 30
дней. Количество здоровых, больных и погибших мышей регистрируют в журнале.
9.4 Обработка результатов
При оценке результатов учитывают наличие клинических признаков у зараженных мышей
(взъерошенность шерсти, поедаемость корма, нарушение координации движения, параличи, тремор,
прострация). Гибель мышей в первые двое суток после заражения не учитывают. Пробы мозга от
больных и погибших животных, начиная с третьих суток, исследуют МФА по 7.
Биопробу считают положительной, если, начиная с третьих суток после заражения, заболела
и погибла хотя бы одна мышь и в пробе мозга с помощью МФА обнаружены специфические включе
ния вируса бешенства.
Отрицательный диагноз может быть дан только по истечении 30 сут наблюдения при условии,
что все зараженные животные останутся живыми издоровыми.
Результаты биопробы считаются окончательными, дальнейшие исследования не проводят.
10 Метод иммуноферментного анализа (ИФА)
10.1 Сущность метода
В основе ИФА лежит специфическое взаимодействие антигена вируса бешенства с антите
лом, иммобилизованным на твердом носителе. Связанный антиген выявляется с помощью второго
антирабического антитела, меченного пероксидазой, продукт реакции которой окрашивается при до
бавлении хромогена. Интенсивность окрашивания продукта реакции прямо пропорциональна количе
ству антигена.
10.2 Подготовка к исследованию
10.2.1 В качестве исследуемого материала (антиген) используют пробы ткани головного мозга
павших, вынужденно убитых, подозреваемых в заболевании бешенством или экспериментально за
раженных вирусом бешенства животных.
10.2.2 Приготовление исследуемого антигена
Пробы ткани головного мозга, полученные по 6.5, измельчают, растирают в ступке и готовят
10 %-ные суспензии в 0,9 %-ном изотоническом растворе хлористого натрия, прогревают в водяной
бане при температуре 60 °С в течение 15 мин и центрифугируют в течение 5 - 1 0 мин при
скорости 2000 об/мин. Надосадочную жидкость используют в качестве исследуемого антигена.
10.2.3 Подготовка реагентов
Все растворы и реагенты перед постановкой реакции необходимо выдержать не менее 30 мин
при температуре (22 ± 1) °С.
Подготовку компонентов набора проводят согласно инструкции по применению.
10.3 Проведение исследования
10.3.1 ИФА проводят в сэндвич-варианте с использованием компонентов, входящих в набор
для выявления антигена возбудителя бешенства в патологическом материале.
Для проведения ИФА используют планшеты для иммунологических реакций с плоским дном.
Объем ингредиентов, вносимых поэтапно в лунки планшета, равен между собой и составляет
0,1 см3.
10.3.2 Сенсибилизация планшета
В лунки полистиролового планшета вносят АнГ в рабочем разведении, указанном на этикетке.
Планшет с АнГ накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37 ± 0,5) °С в тече ние
3 ч или при температуре 4 °С в течение 18 ч. По окончании инкубации лунки планшета трехкратно
промывают отмывающим буферным раствором. При каждой отмывке содержимое лунок вытряхива ют,
а остатки раствора удаляют постукиванием о фильтровальную бумагу.
10.3.3 Внесение антигенов
В ряды планшета А, В и С вносят отмывающий буфер. В лунки планшета вносят контрольные
положительный (лунка А1) и отрицательный (лунка А2) антигены, входящие в состав набора, а также
исследуемые пробы (лунки АЗ, А4 и т.д.) и титруют по вертикали, получая разведения от 1 : 2 до 1 : 8.
При большом количестве проб заполняют идругие ряды планшета. Планшет накрывают крышкой и
инкубируют в термостате при температуре (37 ± 0,5) °С в течение
1
ч. По окончании инкубации про
водят трехкратную отмывку лунок планшета от не связавшихся с иммуноглобулином антигенов, как
описано в 10.3.2.
7