ГОСТ 26075-2013
щих антител.
Метод является альтернативным биопробе на белых мышах по 9.
8.2 Подготовка к исследованию
8.2.1 Подготовка проб
Равные части ткани, стерильно отобранные из каждого участка головного мозга мелкого жи
вотного (аммоновы рога, мозжечок, кора больших полушарий, продолговатый мозг), или кусочки
ткани из каждого отдела головного мозга крупного животного, отобранные по 6.5, измельчают ножни
цами и растирают в ступке или гомогенизаторе, постепенно добавляя стерильный 0,9 %-ный изотони
ческий раствор натрия хлорида до получения10 %-ной суспензии. В суспензию мозга добавля
ют пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/см3и 1 мг/см3соответственно.
Полученную суспензию тщательно перемешивают и центрифугируют в течение 5-10 мин при
скорости 2000 об/мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильную пробирку и хранят при тем
пературе не выше 4 °С до использования.
8.2.2 Подготовка культуральных стекол
Суточную культуру клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) снимают с культу
рального флакона при помощи 0,25 %-ного раствора трипсина и разводят средой ДМЕМ с 10 %-ной
эмбриональной сывороткой крови крупного рогатого скота и 3 %-ным глютамином до концентрации 2 х
105 клеток/см3. В лунки культурального стекла вносят по 0,1 см3полученной суспензии клеток, на
крывают крышкой и помещают во влажный С02-инкубатор с содержанием С02 5 % при температуре (37
± 1) °С на 18-20 ч.
8.3 Проведение исследования
В две лунки культурального стекла по 8.2.2 вносят по 0,05 см3суспензии из каждого отдела
головного мозга. На каждом стекле оставляют две лунки для положительного и отрицательного кон
троля. В качестве положительного контроля используют суспензию мозга мыши, зараженной вирусом
бешенства - штаммом CVS. В качестве отрицательного контроля вносят суспензию мозга клинически
здоровой мыши. Культуральное стекло помещают во влажный С02-инкубатор с содержанием С025 %
при температуре (37 ± 1) °С на 42 - 48 ч.
По окончании инкубации с помощью автоматической пипетки из лунок культурального стекла
удаляют среду, один раз промывают клетки ФБР (с помощью автоматической пипетки вносят по 0,2
см3раствора в каждую лунку) и подсушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20 - 30 мин.
Затем в каждую лунку вносят по 0,1 см3охлажденного до температуры минус 20 °С ацетона и остав
ляют при комнатной температуре на 30 мин.
После фиксации клеток культуральное стекло переворачивают и встряхивают для удаления
ацетона, а затем высушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20 - 30 мин. С помощью
скальпеля и пинцета удаляют пластиковую насадку и подсушивают стекло еще в течение 5-10 мин. В
каждую лунку добавляют по 0,05 - 0,10 см3ФАГ в рабочем разведении (подбирают опытным путем),
приготовленном в ФБР, помещают во влажную чашку Петри и инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в
течение 30 мин.
По окончании окрашивания стекла трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10
мин в сосуд с ФБР. Затем препараты ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воз
духе втечение 20 - 30 мин.
На окрашенные препараты наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматри
вают влюминесцентном микроскопе.
8.4 Обработка результатов
В окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства культура клеток светится туск
лым, серовато-желтым цветом (отрицательный контроль). Антиген вируса бешенства выявляется в
цитоплазме культуры клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины с четкими
очерченными краями (положительный контроль).
Диагноз на бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа
в исследуемом препарате обнаруживают типичные желто-зеленые гранулы.
Если в культуре клеток вирус бешенства не выявлен, то ставится отрицательный диагноз.
Результаты выделения вируса бешенства в культуре клеток окончательные, дальнейшие ис
следования не проводят.
9 Биопроба на белых мышах
9.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в выделении вируса бешенства путем интрацеребрального
введения патологического материала белым мышам с последующей идентификацией вируса мето
дом флуоресцирующих антител по 7.
6