ГОСТ Р 55302—2012
ти Оф по 4.6.1.5 при колориметрировании в кювете с толщиной поглощающего светового слоя 10 мм
лежали вдиапазоне значений 0.8—1,1.
При отклонении оптической плотности от указанныхзначений необходимо подобрать разведение
препарата таким образом, чтобы оптическая плотность окрашенных растворов Оф по 4.6.1.5 соответ
ствовала указанным пределам диапазона.
Каждую пробу анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями
ГОСТ Р ИСО 5725-1 и ГОСТ Р ИСО 5725-2.
Раствор готовят вдень определения. Длительность использования рабочего раствора фермент
ного препарата не должна превышать 1 ч с момента приготовления во избежание потерь его фермен
тативной активности.
4.6 Проведение анализа
4.6.1 Проведение ферментативной реакции
4.6.1.1 В две пробирки (16 х 150 мм) вносят по 0.5 см3 субстрата ксилана по 4.4.4. В пробирки
добавляют по 0,3 см3дистиллированной воды. Содержимое пробирок перемешивают и прогревают в
ультратермостате с температурой (50 ♦ 1) вС в течение 5 мин.
4.6.1.2 В пробирки добавляют по 0,2 см3 рабочего раствора анализируемой пробы ферментного
препарата по4.5.3. предварительно прогретого до температуры (50 ± 1) °С. и тщательно перемешива
ют. Реакционную смесь инкубируют при температуре (50 ♦ 1) °С в течение 10 мин. ведя отсчет с момен та
начала ферментативной реакции.
4.6.1.3 По окончании реакции в пробирки вносят по 1 см3 реактива Шомоди по 4.4.2, тщательно
перемешивают, закрывают стеклянными пробками, помещают в кипящую водяную баню на 20 мин.
4.6.1.4 Пробирки охлаждают в холодной воде, добавляют 1,0 см3 реактива Нельсона по 4.4.3,
перемешивают и выдерживают 10 мин, периодически тщательно перемешивая. Полученные растворы
приобретают синюю или бирюзовую окраску различной интенсивности. При образовании осадка или
мути впробирки добавляют по 1 см3ацетона и перемешивают до полного их исчезновения. В этом слу
чае ацетон добавляют впробирки контрольного раствора на реактивы по 4.6.2 и раствора субстрата по
4.6.3.
4.6.1.5 Содержимое пробирок доводят до общего объема 10 см3 дистиллированной водой и
измеряют оптическую плотность Оф на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при длине
световой волны Х= 610 нм в кюветах с толщиной поглощающего светового слоя 10 мм против кон
трольного раствора на реактивы по 4.6.2. Значение оптической плотности должно быть в диапазоне
0
.
8
—
1
.
1
.
4.6.1.6 Если значение оптической плотности опытной пробынаходится за пределами рабо
чей зоны градуировочного графика и не укладывается вдиапазон ее значения, определение активнос
ти следует повторить с рабочим раствором анализируемого образца, содержащим большее или
меньшее количество фермента соответственно.
4.6.2 Определение оптической плотности контрольного раствора на реактивы
Измерение оптической плотности опытной пробы Оф. раствора субстрата Dcи рабочего раствора
фермента 0оосуществляют против кюветы с контрольным раствором на реактивы. Контрольный рас
твор на реактивы готовят, внося в пробирку 0.5 см3 ацетатного буферного раствора по 4.4.1. 0.5 см3
дистиллированной воды и 1 см3 реактива Шомоди по 4.4.2. Содержимое пробирки перемешивают и
инкубируют в кипящей водяной бане 20 мин. Дальнейшие операции осуществляют аналогично
4.6.1.4—4.6.1.5.
4.6.3 Определение оптической плотности раствора субстрата
В пробирку вносят по 0,5 см3 субстрата ксилан по 4.4.4, добавляют 0.5 см3 дистиллированной
воды и 1 см3 реактива Шомоди по 4.4.2. Содержимое пробирки перемешивают и инкубируют вкипящей
водяной бане 20 мин. Дальнейшие операции осуществляют аналогично 4.6.1.4—4.6.1.5. Показания
оптической плотности раствора субстрата обозначают Ос.
4.6.4 Определение оптической плотности рабочего раствора фермента
В пробирку вносят 0.5 см3 ацетатного буфера по 4.4.1, добавляют 0.3 см3 дистиллированной
воды и 0,2 см3рабочего раствора фермента по4.5.3, затем добавляют 1см3реактива Шомоди по4.4.2.
Содержимое пробирки инкубируют в кипящей водяной бане 20 мин. Дальнейшие операции осуще
ствляют аналогично 4.6.1.4—4.6.1.5. Показания оптической плотности рабочего раствора фермента
обозначают как DQ.
7