ГОСТ 31486—2012
5.3.5Для построения градуировочного графика в семь пробирок вместимостью 10 см3вносят по
0.5 см3окрашенного субстрата по 5.3.2. добавляют по 0.5 см3одного из разведений рабочего стан
дартного раствора ксиланазы в соответствии с таблицей 2и перемешиваютс помощью вортекса со ско
ростью встряхивания от 1000 до 1500 мин-’.
Одновременно готовят контрольную пробу на реактивы, для чего в пробирку вносят 0.5 см3окра
шенногосубстратапо5.3.2. добавляют0.5 см3ацетатногобуферного раствора по5.3.1 иперемешивают с
помощью вортекса со скоростью встряхивания от 1000до 1500 мин-’.
Все пробирки (семьопытныхи одну контрольную)помещают в термостат (ультратермостат)стем
пературой (4011) °С на 20 мин (посекундомеру).
После извлечения пробирок изтермостата во все пробиркидобавляют по2.5 см3 96 %-ногоэтило
вогоспирта (осадителя).
Все пробирки выдерживают 10 мин при комнатной температуре изатем центрифугируют приугло
вой скоростиот 5000до 7000 мин"’.
Интенсивность окраски измеряют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 490 нм
посравнению с контрольной пробой на реактивы.
Пополученным значениям строят градуировочный график: на оси абсцисс откладываютактивнос
ти разведений стандартного раствора ксиланазы КсА, ед./см3; на оси ординат — соответствующие им
значения оптических плотностей в единицах ОП.
Дляпостроения каждойточкиградуировочногографика вычисляютсреднеарифметическоезначе
ниеоптической плотноститрехпараллельныхизмеренийдля каждойактивностистандартногораствора
ксиланазы.
Градуировочиый графикстроятдля каждой новой партииазоксилана. атакжепри заменеприбора.
5.4 Подготовка пробы
5.4.1 Отбор проб проводят по4.4.1.
5.4.2 Приготовлениеосновного раствора анализируемого образца проводят по4.4.2.
5.4.3 Рабочий растворанализируемого образцаготовятизосновного раствора по5.4.2 путем раз
ведения его дистиллированной водой таким образом, чтобы при определении активности оптические
плотности опытного и контрольного растворов находились в пределах рабочей зоны градуировочного
графика.
Рабочий раствордолжен содержатьот 0.15 до 0.75 единиц активности в 1см3.
5.5 Проведение анализа
5.5.1 В три опытные пробирки вместимостью 10 см3вносят по 0,5 см3раствора окрашенного суб
страта по 5.3.2. Пробирки помещают в ультратермостат или водяную баню с температурой (40 * 1) вС и
выдерживают в течение 5 мин. затем вносят 0.5 см3 рабочего раствора анализируемого образца, пред
варительнопрогретоговультратермостате или на водянойбане стемпературой(40±1) "С. иперемеши
вают с помощью вортекса со скоростью встряхивания от 1000 до 1500 мин 1.
5.5.2 Одновременно готовят контрольную пробу: в пробирку вместимостью 10 см3вносят 0.5 см3
раствора окрашенного субстрата по 5.3.2.2.5 см396 %-ного этилового спирта (осадителя) и перемеши
ваютс помощью вортекса соскоростью встряхиванияот 1000до 1500 мигг’.после чегодобавляют0,5см3
рабочего раствора анализируемого образца.
5.5.3 Все пробирки (три опытные иодну контрольную)закрывают пробками и помещают в ультра
термостатс температурой (40 ± 1) “Си выдерживают в течение20 мин (при анализе кормов — 1ч).
5.5.4 Втри опытные пробирки вносят по 2.5 см396 %-ногоэтилового спирта (осадителя). переме
шивают с помощью вортекса со скоростью встряхивания от 1000 до 1500 мин-’ и выдерживают 10 мин
при комнатной температуре.
5.5.5 Пробирки (три опытные иодну контрольную)центрифугируют 5 мин при угловой скорости от
5000до 7000 мин-’. Отбирают супернатанти проводят измерениеоптической плотности нафотоколори
метре или спектрофотометрепри 490 нм против контрольной пробы.
5.6 Обработка результатов
5.6.1Активность эндоксиланазы (эндо-КсА) в анализируемом образце, ед./r, рассчитывают по
формуле
КсА = * .<5>
с
гдеА — активность разведения рабочего раствора, определенная по градуировочному графику 5.3.5.
ед./см3;
8