ГОСТ Р 53360—2009
По полученным значениям строят градуировочный график, для чего по оси ординат откладывают
величины оптическойплотности в единицах ОП. а пооси абсцисс — молярные концентрации фосфатов в
мкмоль/см3.
Рабочая зона градуировочного графика лежитв пределах от 0.25до 0,60единиц оптической плот
ности (ед. ОП).
Для построения каждойточки градуировочного графикавычисляютсреднеарифметическое значе
ние оптической плотности трех параллельных измерений.
Градуировочный график строятдля каждой новой партии реактивов, а также при замене прибора.
4.4 Подготовка пробы
4.4.1 Отбор проб проводят по ГОСТ 20264.0.
Анализируемые образцы в форме порошка или микрокапсулированные можно использовать без
предварительной подготовки. Анализируемыеобразцы вформе гранулследуетизмельчать(например,
на зерновой мельнице или в фарфоровой ступке) и просеивать через сито с диаметром отверстий не
более 1мм.
4.4.2 Приготовление основного раствора анализируемого образца
В плоскодонную стеклянную колбу помещают навеску анализируемого образца массой от 0.1 до
ЮГ* с точностью до 0.2 мг и суспендируют в небольшом количестве бидистиллированной воды
(до 50 см3)на магнитной мешалке втечение 15 мин(порошок, микрогранулы, микрокапсулы)или 60
мин (корма, кормовые смеси). Суспензию количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100
см3и доводят объем бидистиллированной водойдо метки. Полученную суспензию центрифугируют
при час тоте вращения 7000мин-’ в течение 15 мин.Для анализа используют надосадочную жидкость.
Раствор готовят вдень определения.
4.4.3 Приготовление рабочего раствора анализируемого образца
Рабочий раствор готовятизосновного растворапо4.4.2 путем его разведения вбидистиллирован
ной воде (например, в 20 раз)таким образом, чтобы при определении активности оптические плотности
опытных и контрольного растворов находились в пределах рабочей зоны градуировочного графика.
4.5 Проведение анализа
4.5.1 В три пробирки (две опытные и одну контрольную) вносят по 1.0 см3рабочего раствора ана
лизируемого образца по 4.4.3. Пробирки помещают в ультратермостат или водяную баню с температу
рой (37 ± 1)°С ивыдерживают втечение 5 мин.
4.5.2 В две опытные пробирки добавляют по 1.0 см3раствора субстрата фитата натрия по 4.3.4,
предварительно выдержанного в ультратермостате или водяной бане с температурой (37 * 1)°С в тече
ние 5 мин. и перемешивают. Пробирки помещают в ультратермостат или водяную баню стемпературой
(37 ± 1)°С на 15 мин.
4.5.3 В контрольную пробирку вносят 1,0 см3раствора субстрата фитата натрия по 4.3.4. В конт
рольную идве опытные пробирки добавляют по 2.0 см3раствора натрия молибдата по 4.3.2 и 0.5 см3
рабочего раствора олова хлорида по4.3.3 и тщательноперемешивают.
4.5.4 Пробирки(двеопытные иоднуконтрольную)выдерживаютоднумин при комнатнойтемпера
туре. Растворы колориметрируютпри длине волны от 650до 700 нм. в кюветестолщинойпоглощающего
светслоя3 мм, против контроля на реактивы. При необходимости (опалесценция, взвесь ит.д.) раствор
центрифугируют при 7000 мин-’.
5 Метод определения ферментативной активности фитазы
с образованием фосфорнованадиево-молибденового комплекса
5.1 Характеристика метода
5.1.1 Метод основан на определении содержания неорганических фосфатов (Р04). образующих
ся в результате действия фермента фитазы на субстрат — фитат натрия (натриевую соль фитиновой
кислоты) — при определенныхстандартныхусловиях, путем ихсвязывания ванадиево-молибденовым
реактивом собразованием фосфорнованадиево-молибденового комплекса желтого цвета.
5.1.2 За единицуфитазнойактивности (1 ед. ФА)принимают количество фермента, катализирую
щего гидролиз фитатанатриясобразованием одного мкмолянеорганическогофосфатазаоднуминутув
стандартныхусловиях (температура 37 вС, значение pH 5.5. продолжительность гидролиза 15 мин).
5.1.3 Интенсивностьокраскиизмеряютфотоколориметрическим методом при длине волны от400
до415нм.
* В зависимости от предполагаемой активности.
5