ГОСТ Р 52840— 2007
8.3.6Аппликатор, наполненный образцами по 8.3.5. помещают е систему со стороны катода и прово
дят ИЭФ в автоматическом режиме на полиакриламидных гелях по программам в соответствии с таблица
ми 1 и (или) 2.
Выбор программы зависит от цели анализа: для выбора оптимального диапазона pH при измерении
иэоэлектрическихточек используют широкий диапазон pH 3.0 — 9.0. для характеристики и анализа белков с
небольшими различиями в иэоэлектричесхой точке используют более узкие диапазоны: pH 5.0 — 9.0 и pH 4.0
— 6.5.
Программы проведения изоэлектрофокусирования в широком и узких диапазонах pH состоят из трех
этапов:
- префокусирование (происходит формирование градиента pH):
- этап нанесения исследуемых образцов (белки вносятся в гель);
- этап разделения (белки мигрируют к своим изоэлектричесхим точкам).
Т а б л и ц а 1— Программа проведения анализа ИЭФ в полиакриламидном геле в широком диапазоне
pH 3.0 —9.0
Наименование этапа
Номер
Условия
этапа
Напряжение. В
Ток. мАМощность. ВтТемпература. "С
Префокусированив
1.12000
Нанесение образца
1.22002.53.515
Разделение
1.32000
Т а б л и ц а 2 — Программа проведения анализа ИЭФ в полиакриламидном геле в узких диапазонах pH:
5.0—8.0 или 4.0—6.5
Н аим енование этапа
Н омер
У словия
этапа
Н апряжение. В
Ток.
мАМ ощ ность. ВтТемпература. "С
Префокусированив
2.12 0 0 0
Нанесение образца
22
2 0 02 .03 .51 5
Разделение
2 .32 0 0 0
Этап фокусирования продолжается от 8 до 10 мин. Общее время ИЭФ составляет около 30 мин.
После окончания ИЭФ полиакриламидный гель помещают в камеру для окрашивания.
8.4 Проведение окрашивания
Полиакриламидные гели окрашивают в автоматическом режиме с применением красителя кумасси
бриллиантового голубого в соотвествтвии с таблицей 3 для образцов с высоким (от 20до 50 нг/мкл)содер
жанием белка или с применением азотнокислого серебра в соответствии с таблицей 4 для образцов с
низким содержанием белка (от 1до 5 нг/мкл).
Таб лиц а 3 — Программа окрашивания полиакриламидных гелей с помощью раствора кумасси брилиантоеого
голубого
Номер
этапа
Наименование раствора
Время, мин
Температура. "С
1Фиксирующий
5
20
2Промывной
2
20
3Окрашивающий
10
50
4Промывной
5
50
5Консервирующий
10
50
2*5