Приложение В
(справочное)
ГОСТ Р ЕН 12296—2009
Сведения о методах контроля чистоты
В.1 Общие положения
Существуют четыре метода контроля чистоты оборудования (3): визуальный осмотр, мазки тампоном с внут
ренних поверхностей, отбор проб моющей жидкости после последней промывки и контроль загрязнений в последу
ющей загрузке (серии продукции).
В.2 Визуальный осмотр
Остаточное загрязнение, адсорбированные микробные популяции или следы индикаторов могут быть обна
ружены при визуальном осмотре оборудования или с использованием методов микроскопии таких, как световая
микроскопия, сканирующая или просвечивающая эпектронная микроскопия (4]. При применении этих методов, как
правило, необходим доступ к контролируемым поверхностям.
В.З Мазки с внутренних поверхностей
Количественную оценку индикаторов (химического или биологического происхождения) можно провести
путем взятия мазков с определенных участков оборудования, которые вступают в контакт с продуктом. Мазки с лег
ко доступных плоских поверхностей оборудования могут дать сверхоптимистические результаты в отношении чис
тоты. Мазки с малодоступных мест могут дать сверхпессимистические результаты. Для получения статистически
значимых результатов важно правильно определить места и площади для взятия мазков с оборудования. Мазки
могут быть взяты непосредственно, например, с помощью агаровых пластинок, или косвенно, например, с исполь
зованием таких материалов, как хлопок, шерсть, альгинатных наконечников или пластин Petnlilm. При применении
этого метода испытания необходим доступ к контролируемым поверхностям.
В качестве примера ниже приведен очень чувствительный, простой и недорогой метод для определения ами
нокислот и протеинов, остающихся на поверхности оборудования. Данный нингидриновый метод основан на реак
ции аминокислот, пептидов и протеинов с трикетогидринденгидратом. Эта известная реакция широко используется
при тонкослойной хроматографии. Преимуществом данного метода для биотехнологических процессов по сравне
нию с методом остаточных загрязнений является возможность обнаружить широкий спектр веществ из культураль
ной среды и микроорганизмов таких, как аминокислоты, пептиды и протеины. Таким образом, один и тот же метод
позволяет определять разнообразные среды, клеточные культуры, белковые жидкости и суспензии. Благодаря
простоте и легкости выполнения данный метод используют в сложных и спорных случаях, а также для доказа
тельства эффективности методов очистки, особенно для оборудования производителей или пользователей, кото
рые не имеют лабораторий.
Порядок работы: отбирают пробу методом мазка с определенной площади с помощью ролика из влажного
хлопка или шерсти.Для определения аминокислот, пептидов и протеинов непосредственно на поверхность хлопко
вого ролика наносят несколько капель нингидринового реагента, а затем выдерживают при температуре от 110 ‘С до
120 ‘С в течение времени от 20 до 30 мин. В случае наличия остатков на поверхности ролика появится фиолето вая
окраска. Для доказательства эффективности очистки оборудования оно может быть загружено веществом,
окрашиваемым нингидрином (например, аминокислотой типа аргинина), затем очищено, после чего проводят ана
лиз на наличие остатков данного вещества. Чувствительность этого метода каргинину составляет приблизительно 1
мг/м2.
Для приготовления нингидринового реагента к смеси 100 мл л-бутанола и 3 мл ледяной уксусной кислоты
добавляют 0.30 г нингидрина.
В.4 Отбор проб моющей жидкости после последней промывки
Моющая жидкость после последней промывки может быть проверена на наличие индикатора, продукта или
технологических сред.
Примерами загрязнений являются:
- жизнеспособные микроорганизмы (2J;
- общее содержание протеинов.
- липополисахариды.
- соли, сахара (7);
- общий органический углерод (ООУ).
Следует обратить внимание на то, чтобы загрязняющие вещества были растворены или суспендированы в
моющей жидкости, которая должна иметь хороший контакт со всеми частями оборудования.
В.5 Контроль загрязнений в следующей серии
Контрользагрязненийвследующейсериилродукции (например, индикаторы, используемые всоответствии с
методом контроля, указанным в подразделе В.З) не является лучшим методом контроля эффективности очистки
оборудования, но он может быть использован, если по каким-либо причинам приведенные выше методы неприме-
5