сахароза - 30,0 г;
агар-агар - 15 г;
вода дистиллированная и стерильная - 1000 мл.
Навеску каждого указанного в рецепте химического вещества, за исключением
сахарозы, растворяют в химических стаканах небольшим количеством воды из
мерного цилиндра.
Все растворы по порядку вливают в колбу емкостью 1 л и тщательно
перемешивают, добавляя оставшуюся воду из цилиндра. Затем опускают в колбу
кусочки агар-агара, энергично взбалтывают содержимое колбы и ставят ее на
водяную баню для варки питательной среды. Питательную среду следует варить
при температуре кипения воды до полного расплавления агар-агара. В
полученную однородную массу добавляют сахарозу, после чего содержимое
колбы снова тщательно перемешивают и фильтруют через гигроскопическую
вату. Готовая питательная среда должна иметь рН 5,5-6,5. Готовую питательную
среду разливают в пробирки по 4-5 или 9-10 мл.
Пробирки и колбы с питательной средой закрывают ватными пробками и
стерилизуют.
После стерилизации пробирки с 4-5 мл питательной среды размещают при
комнатной температурев наклонном положении(подуглом 10-15°) к
горизонтальной поверхности с тем, чтобы при застывании образовалась косая
поверхность среды.
После этого среда готова к посеву. Среду, разлитую в пробирку по 9-10 мл,
используют для приготовления контрольных агаровых пластинок в чашках Петри;
б) готовое пивное сусло можно получить на пивоваренных заводах: для
культивирования грибов используют сусло, содержащее 3% сахара. Для этого
готовое сусло разбавляют дистиллированной водой, определяя процент
содержания сахара сахариметром. При этом рН среды должно быть 5,5-6,5.
Приготовление твердой питательной среды сусло-агара производят путем
добавления 1,5% агар-агара. Для его расплавления среду нагревают на водяной
бане. Расплавленный сусло-агар разливают в пробирки или колбы и стерилизуют.
Б. Методы стерилизации питательных сред и посуды
Посуду,используемуюдлявыращиваниямикроорганизмов,готовые
питательные среды, разлитые в пробирки или колбы, закрытые ватными
пробками, подвергают стерилизации, т.е. обеспложиванию. Стерилизацию
питательных сред, резиновых и других предметов производят насыщенным паром
под давлением в автоклаве.
Посуду (пипетки, чашки Петри, пробирки и др.) стерилизуют сухим жаром в
печах Пастера или сушильных шкафах.
В мерный цилиндр наливают 1 л (1 дм ) дистиллированной стерильной воды.
а) Стерилизацию насыщенным паром осуществляют в автоклаве при давлении
1,5 кгс/смили 2 кгс/сми температуре 112 °С или 121 °С соответственно.
Порядок приготовления питательной среды Чапек-Докса приведен ниже.
Среду Чапека-Докса и сусло-агар стерилизуют при давлении 1,5 кгс/смв
течение 20-30 мин.
б) Стерилизацию сухим жаром производят в специальных сушильных шкафах-
печах Пастера или в электросушильных шкафах с нагревом до 200 °С. Хорошо
вымытую и высушенную посуду перед стерилизацией завертывают в бумагу
(каждый предмет отдельно) и помещают в сушильный шкаф. Нагревание
производят в течение 2 ч при температуре 160-170 °С.
В. Пересевы микроорганизмов
Грибы, предназначенные для заражения испытываемых образцов, сохраняют в
так называемой чистой культуре. Каждый раз для работы производят пересев
микроорганизмов.Пересевомназываютпереноснебольшогоколичества
микроорганизмов из чистой культуры в сосуды (пробирку или чашку Петри) со
стерильной питательной средой. Пересев производят в стерильных условиях,
чтобы не загрязнить культуру другими микроорганизмами из воздуха. Для
переноса используют изолированные маленькие комнаты (боксы), где воздух
предварительно очищают облучением бактерицидными лампами. Перенос
культуры грибов совершают с помощью бактериологической петли или иглы,
конец которой может быть загнут под прямым углом в виде небольшого крючка.
Бактериологические петли или иглы, которые укрепляются в держателе,
изготовляют из платиновой, хромоникелевой или вольфрамовой проволоки
толщиной 0,5 мм и длиной 5-10 см.
Порядок работы при пересеве микроорганизмов должен быть следующим:
1. Зажечь спиртовку или газовую горелку.
2. Взять в левую руку две пробирки: одну со свежей стерильной питательной
средой (ближе к себе), другую с культурой микроорганизма.
3. Взять правой рукой держатель петли или иглы, прокалить их в пламени
спиртовки (до красного каления) и обжечь часть держателя.
4. Открыть одновременно пробирки, плавно зажав ватные пробки мизинцем
правой руки.
5. Обжечь края пробирок.
6. Ввести петлю или иглу в пробирку с микроорганизмами, и, захватив
наибольшее количество спор грибов, перенести их, не касаясь стенок пробирки,
на поверхность свежей питательной среды в другой пробирке.
7. Обжечь одновременно обе пробки и края пробирок и также одновременно в
пламени закрыть обе пробирки.