9
- Детекция (обнаружение) продуктов амплификации
- Детекцию продуктов амплификации фрагментов видоспецифичной ДНК методом электрофореза проводят по ГоСт Р 527231.
Регистрацию и документирование полученных результатов путем занесения в базу данных компьютера осуществляют при помощи системы для документирования гелей по ГОСТ Р 52723 в соответствии с прилагаемым к ней техническим описанием.
- Детекцию продуктов амплификации фрагментов видоспецифичной ДНК птиц в режиме реального времени проводят по ГОСТ Р 527232.
Результаты качественного анализа отображаются с помощьюпрограммного обеспечения прибора в виде кривых флуоресценции и в виде табличных данных, содержащих количество циклов /од-фазы (ГОСТ Р 52723), полученных для анализируемых проб, а также отрицательной (К-) и положительной (К+) проб.
- Обработка результатов анализа
- ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза
Оценку результатов анализа проводят визуально сравнением взаимного расположения на элек- трофореграммах анализируемой пробы и контрольных проб полос, соответствующих видоспецифичному фрагменту ДНК птиц, полученному в реакции с положительным контролем К+.
Положительными, то есть содержащими видоспецифичный фрагмент ДНК, считаются пробы, содержащие светящиеся полосы на электрофореграммах не менее чем двух из трех параллельных проб и расположенные на таком же расстоянии от старта, что и полоса, соответствующая положительной контрольной пробе К+. При этом на электрофореграмме отрицательной контрольной пробы К- соответствующая полоса должна отсутствовать.
Если светящаяся полоса видоспецифического фрагмента ДНК присутствует только на электрофореграмме одной параллельной пробы, а на двух других отсутствует, а также в случае отсутствия полосы фрагмента ДНК на электрофореграмме пробы К+ и/или присутствия полосы на фореграмме пробы К-, то результат считается сомнительным. В этом случае необходимо провести повторную амплификацию с анализируемым экстрактом ДНК. Если удовлетворительный результат не будет достигнут и в этом случае, то необходимо провести повторный анализ, начиная с выделения ДНК из новой пробы исследуемого яичного продукта.
- RT-ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени
Оценку результатов анализа проводят визуально сравнением кривых флуоресценции для анализируемых проб и контрольных проб К- и К+, а также по значениям циклов /од-фазы.
Положительными, то есть содержащими видоспецифичный фрагмент ДНК, считаются пробы, для которых в процессе амплификации наблюдается увеличение интенсивности флуоресценции (кривая флуоресценции имеет S-образную форму) и количество циклов /од-фазы имеет конечное значение (не более 40). При этом должны выполняться следующие условия: для всех положительных проб К+ должно наблюдаться увеличение интенсивности флуоресценции и кривая флуоресценции должна иметь S-образную форму; в контрольных отрицательных пробах К- не должно происходить накопление продуктов ПЦР, поэтому график флуоресценции для всех этих проб должен иметь вид прямой линии. При нарушении хотя бы одного из этих условий необходимо провести повторную амплификацию с анализируемым экстрактом ДНК. Если удовлетворительный результат не будет достигнут и в этом случае, то необходимо провести повторный анализ, начиная с выделения ДНК из новой пробы исследуемого яичного продукта.
- Оформление результатов анализа
При положительной детекции продуктов амплификации в протоколе испытаний указывают: «Видоспецифичный фрагмент ДНК [вид птицы] — обнаружен».
- Требования к условиям проведения анализа
Устройство лаборатории для проведения анализа методом ПЦР, условия и процедура анализа должны удовлетворять требованиям ГОСТ Р 52723 и ГОСТ Р 53214.
- 1 Детекцию данным методом проводят в случае анализа по 7.1.
- 2 Детекцию данным методом проводят в случае анализа по 7.2.