ГОСТ Р 54056-2010; Страница 7

миллиграммах.

1. Лизис клеток, сорбцию и очистку ДНК проводят по ГОСТ Р 52723 в пробирках с подготовлен­ной по 6.3.5 пробой.
2. Приготовленный по 6.4.2 очищенный экстракт ДНК переносят в чистую микропробирку, не задевая при этом осадка, поскольку попадание в нее сорбента может в дальнейшем приводить к ингиби­рованию ПЦР. Полученный экстракт ДНК используют для проведения амплификации и при необходи­мости хранят при температуре 4 °С не более 1 мес или при температуре минус 18 °С не более одного года.
3. В чистую микропробирку отбирают 0,03—0,08 см3 ТЕ-буфера (элюирующего раствора) по ГОСТ Р 52723 и используют при проведении амплификации в качестве контрольной отрицательной про­бы (проба К-).

1. Проведение анализа

Для выявления фрагментов видоспецифичной ДНК растений и животных используют наборы реа­гентов для амплификации методом ПЦР, содержащие праймеры 4, специфичные к ДНК определенного вида птиц.

1. Амплификация фрагментов видоспецифичной ДНК птиц с детекцией продуктов ампли­фикации методом электрофореза
1. В штативе размещают и маркируют необходимое число микропробирок с лиофильно высу­шенной амплификационной ПЦР-смесью по ГОСТ Р 52723 (три пробирки для каждой пробы), включая пробирки для положительного и отрицательного контролей.
2. В каждую микропробирку с ПЦР-смесью при помощи автоматического дозатора по ГОСТ Р 52723 последовательно вносят 10 мм3 ПЦР-растворителя по ГОСТ Р 52723 и 5 мм3 смеси прай­меров 4для выявления фрагмента видоспецифичнойДНКптиц. Перед использованием смесь прайме­ров необходимо разморозить в твердотельном термостате по ГОСТ Р 52723 при температуре 4 °С, перемешать на микроцентрифуге-встряхивателе в течение 5—10 с, а затем собрать осаждением на дно микропробирки путем центрифугирования на микроцентрифуге-встряхивателе по ГОСТ Р 52723 при 2000 об/мин в течение 3—5 с. Последующую работу с праймерами рекомендуется проводить при температуре от 2 °С до 4 °С с использованием твердотельного термостата с охлаждением по ГОСТ Р 52723.
3. В микропробирку с ПЦР-смесью для отрицательного контрольного образца вносят 5 мм3 ТЕ-буфера (отрицательная контрольная проба К-), подготовленного по 6.1. Затем в микропробирки с ПЦР-смесью добавляют по 5 мм3 экстракта ДНК (6.4.2) (три пробирки для каждого изисследуемыхобраз- цов). В последнюю очередь в микропробирку с ПЦР-смесью для положительного контрольного образца вносят 0,005 см3 положительной контрольной пробы (К+).
4. Содержимое микропробирок растворяют путем легкого перемешивания на микроцентрифу­ге-встряхивателе. После этого собирают осаждением капли ПЦР-смеси со стенок микропробирок путем центрифугирования на микроцентрифуге-встряхивателе по ГОСТ Р 52723 при 2000 об/мин в течение 3—5 с.
5. Если для проведения амплификации используется амплификатор без нагреваемой крышки, то в каждую микропробирку добавляют по 0,020—0,025 см3 (две капли) вазелинового масла.

Плотно закрытые микропробирки центрифугируют в течение 5—7 с на микроцентрифу­ге-встряхивателе при 2000 об/мин и помещают в амплификатор по ГОСТ Р 52723 для проведения амплификации по программе, указанной в таблице 1. По окончании действия программы пробирки извлекают из амплификатора и в штативе передают на этап детекции продуктов ПЦР методом элек­трофореза.