ГОСТ Р 51129-98
7 Полготовка к испытанию
7.1 П р и г о т о в л е н и еб у ф е р н о г о р а с т в о р а а к т и в н о йк и с л о т н о с т ь ю
7,8 pH
7,13 г глицилглииина растворяют в 70 см3 воды и доводят pH раствора до 7,8 с помощью
приблизительно 13 см3 раствора гидроокиси натрия, затем приливают 10 см3 раствора хлористого
пинка и объем доводят водой до 100см’. Буферный раствор устойчив при температуре 4 “С в течение
четырех недель.
7.2 Пр и г о т о в л е н и е раствора НАДН
30 мгдинатриевой соли НАДН и 60 мг двууглекислого натрия растворяют в6 см3воды. Раствор
устойчив при температуре 4 *С в течение четырех недель.
7.3 П р и г о т о в л е н и е с у с п е н з и и МДГ/ЛДГ
0,1 см3 суспензии МДГ, содержащей 5 мг лиофилизата МДГ в 1 см’ (6000 Е/см’), 0.5 см3
суспензии ЛДГ, содержащей 5 мг лиофилизата ЛДГ в 1 см3 (2750 Е/см3) смешивают с 0.4 см3
раствора сульфата аммония. Суспензия МДГ/ЛДГ в растворе сульфата аммония устойчива при 4 *С в
течение 1 г.
7.4 П р и г о т о в л е н и е р а с т в о р а Ш1
168 мг лиофилизата цитратлиазы растворяют в 1 см3 ледяной воды (1.25 Е/см3). Раствор
устойчив при 4 "С в течение одной недели, в замороженном состоянии —четырех недель.
8 Проведение испытания
8.1 П р о в е д е н и е ф е р м е н т а т и в н о г о о п р е д е л е н и я л и м о н н о й ки с ло т ы
Испытание проводят при температуре от 20 до 25 "С. Допускается проведение анализа при
постоянной выбранной температуре в интервале от 25 до 37 “С.
Для дозирования исследуемой пробы и растворов используют пипетки с делениями или
пипеточные дозаторы. Растворы ферментов, коферментов и буфера вносят соответствующими
пипеточными дозаторами.
Ферментативное определение лимонной кислоты может быть проведено также с использова
нием имеющихся в продаже специальных наборов реактивов.
8.1.1 Приготовление пробы
В кювету спектрофотометра (фотометра) вносят 1,00 см3буферного раствора. pH 7.8, 0.1 см3
раствора НАДН. 0,20 см3 раствора исследуемой пробы, 1.80 см’ воды и 0,02 см3 суспензии
МДГ/ЛДГ. Смесь перемешивают, выдерживают в течение 5 мин и измеряют в спектрофотометре
или фотометре оптическую плотность раствора —М,)проб4относительно воздуха.
При высоких значениях начальной оптической плотности (более 1.000) готовят новую пробу,
используя менее концентрированный раствор НАДН. Рекомендуется также уменьшить объем
раствора исследуемой пробы в кювете, компенсируя снижение общегообъема в кювете увеличением
объема воды.
Если массовая концентрация лимонной кислоты в растворе исследуемой пробы менее
20 мг/дм3, то вносимый пипеткой объем может быть увеличен до 2.00 см3. В этом случае следует
снизить объем воды, добавляемой в кювету, для поддержания на постоянном уровне общего
объема в кювете. При расчете результатов необходимо учесть измененный объем раствора
исследуемой пробы в формуле (5).
8.1.2 Реакция с ферментам и количественный шиши
К подготовленному в кювете по 8.1.1 раствору добавляют 0,02 см3раствора ЦЛ. Содержимое
кюветы перемешивают. Через 10 мин измеряют оптическую плотность (Л2)проС» раствора отно
сительно воздуха. Окончание реакции проверяют путем повторного считывания показаний через
2 мин.
8.2 К о н т р о л ь н о еи с п ы т а н и е
В кювету вносят 1,00см3буферного раствора и 0.1 см’ раствора НАДН. 2.00см3воды и 0,02 см3
суспензии ферментов МДГ/ЛДГ, содержимое перемешивают. Через 5 мин измеряют оптическую
плотность раствора (Л,)k011ipailuотносительно воздуха.
К подготовленному в кювете раствору добавляют 0.02 см3 раствора LET. перемешивают,
выдерживают в течение 10 мин и измеряют оптическую плотность (/Г)ком1рои относительно
воздуха.
115
3