ГОСТ Р 57481—2017
8.2.2 Для каждой обогащенной пробы, а также пробы отрицательного контроля готовят по одной
лизис-пробиркеи помещаютв пустойштатив. Отрицательныйконтрольпредставляетсобойстерильную
среду обогащения (забуференную пептонную воду или бульон Фразера полуконцентрированный).
Воизбежание вторичного загрязненияраспечатыватьлизис-пробирки накаждойпластинкеследу
ет поочереди, а перед каждым этапом переноса проб необходимоменять наконечникдля пипетки.
8.2.3 Переносят20 мм3 обогащенной пробы в лизис-пробирку.
8.2.4 Проверяют, нагрелся ли нагревательный блок до температуры (100 ± 1) °С. Помещают
штатив с лизис-пробирками в нагревательный блок иоставляют нагреваться в течение (15± 1) мин.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ
—
Пробы, не прошедшие должную температурную обработку во
времяэтапализиса, могут представлять биологическую опасность, поэтомуне допускает
ся вставлять их в прибор для молекулярного анализа.
Во время тепловой обработки цвет раствора в лизис-пробирках изменится с розового (холодный)
на желтый (горячий).
8.2.5 В качестве альтернативы сухому нагреванию на этапе лизиса можно прибегнуть к нагрева
ниюна водянойбане при (100 i 1)еС. Необходимо, чтобы уровень воды в банебыл выше уровня жидкос ти
в лизис-пробирках. Погружают штатив с лизис-пробирками в водяную баню, нагретуюдо (100 ± 1)°С,
на(15±1)мин.
8.2.6 Извлекают штатив слизис-пробирками из нагревательного блока и помещаютего на охлаж
дение в охладительный блок(вставной) на (10i 1) мин. Во времяохлаждения цвет раствора лизис-про-
бирокснова станет розовым.
8.3 Амплификация
После этапа охлаждения лизис-пробирок из верхней части жидкости в пробирке переносят с
помощью микропипетки 20 мм3содержимого в реагент-пробирки. Переноситьлизат в пробирку следует
под определенным углом, чтобы не потревожить осадок. Перемешивают лизат в пробирке с помощью
пипетки (набирают и выпускаютжидкость из пипетки пять раз).
Реагент-пробирки помещают в прибордля молекулярногоанализа. Для размещения реагент-про
бирок в приборе используютлоток быстрой загрузки. Лоток входит в комплектацию прибора. Запускают
программу. Результаты появятся в течение 75 мин. Положительные результаты могут появиться
раньше.
Цельэтапа:амплификацияДНК искомойбактериальнойклеткии быстрое накоплениеДНК. Побоч
ный продукт амплификации — пирофосфат — вступает в реакцию с термостабильной люциферазой
(входит в комплектреагент-пробирки). Специфическое свечениев результатеданной реакции фиксиру
ется прибором, и результат предоставляется в относительных световых единицах (ОСЕ). Показатель
ОСЕ с определенным порогом чувствительности указывает на наличие/отсутствие патогенных микро
организмов.
8.4 Результаты анализа
Специальный алгоритм анализирует кривую светоотдачи, выводимую в результате обнаружения
амплификации нуклеотидных последовательностей. Программное обеспечение автоматически анали
зирует полученные данные и снабжает их цветовыми кодами. Анализ параметров кривой позволяет
получить положительные или отрицательные результаты. Положительные результаты отображаются в
реальном времени, аотрицательные — по окончании анализа.
Положительныерезультаты следуетподтверждатьсерологическимии биохимическими методами
в соответствии с ГОСТ31659. ГОСТ31468. ГОСТ 32031.
9 Валидация метода
Валидация метода проведена с помощью межлабораторных испытаний по ГОСТ IS 016140.
5