ГОСТ Р 57244—2016
Объем раствора соляной кислоты (Х3) в кубических сантиметрах вычисляют по формуле
_ ть.А
Лз " юоо ’
(
3
)
где т6 — масса стандартного образца сульфата гризина, мг,
А — активность стандартного образца сульфата гризина. ЕД в 1 мг (весовое выражение 1 ЕД
активности сульфата гризина зависит от активности действующего в настоящее время стан
дартного образца);
1000 — активность основного стандартного раствора сульфата гризина. ЕД в 1 см3.
Полученный раствор хранят в колбе с притертой пробкой при температуре 45Св защищенном от
света месте не более одного месяца.
Гризина рабочий стандартный раствор концентрации 3 ЕД в 1 см3; готовят следующим образом:
1см3основного стандартного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3,доводят до
меткилимоннокислым буферным раствором, получая разведение 1:100 (10 ЕД в 1см3). Затем берут пипет
кой 3см3этого разведения, помещают в пробирку, добавляют 7 см3 лимоннокислого буферного раствора.
5.5.2 Подготовка к испытанию
5.5.2.1 Приготовление раствора испытуемого препарата
5 г пробы, взвешенной с погрешностью не более 0,01 г. помещают в ступку, заливают 25 см3 со
ляной кислоты концентрации 0,2 моль/дм3и растирают пестиком. Затем взвесь переносят в колбу или
стакан, а ступку смывают 25 см3раствора соляной кислоты концентрации 0.2 моль/дм3и смыв добав
ляют в колбу.
Взвесь препарата выдерживают в течение 2-3 ч при комнатной температуре для экстракции гризи
на, периодически взбалтывая, после чего содержимое колбы центрифугируют при 2000 мин-1в течение
10-15 мин и фильтруют через бумажный фильтр, получая таким образом разведение 1 ; 10. Затем из
этого раствора готовят следующие разведения с помощью лимоннокислого буферного раствора (с уче
том предыдущего разведения 1 :10):
для кормогризина — 10 - 1 : 1000; 1 : 2000; 1 : 4000,
для кормогризина — 40 - 1 : 4000; 1 : 8000; 1 : 16000.
5.5.2.2 Подготовка чашек Петри с питательной средой и тест-культурой.
Чашки Петри тщательно моют, стерилизуют в сушильном шкафу в течение 2 ч при температуре
160 °С.
В 6 чашек Петри заливают пипеткой по 15 см3расплавленной голодной агаровой среды, получая
нижний слой. В 100 см3расплавленной и охлажденной до 60-65°С питательной агаровой среды вносят
1см3(10 международных единиц мутности) тест-культуры Вас. subtilis 6633 и разливают в чашки Петри на
застывший нижний слой голодной агаровой среды по 7-8 см3.
После застывания агара в чашках делают по 6 лунок буром, которые располагают по радиусам
на расстоянии 2,8 см от центра чашки с интервалом около 60*. В 6 лунок каждой из двух подготовлен
ных чашек Петри вносят капельницей около 0,1 см3 рабочего стандартного раствора гризина. Чашки
помещают в термостат при температуре 37 °С и выдерживают в течение 16—18 ч. а затем измеряют
диаметры зон задержки роста тест-микроба.
Для проведения испытаний препарата на содержание в них гризина используют партию пита
тельной агаровой среды, обеспечивающей после действия рабочего стандартного раствора гризина
зоны задержки диаметром от 17 до 21 мм. В случае получения зон задержки диаметром менее 17 мм или
более 21 мм готовят новую партию среды, подбирая новые серии компонентов, или увеличивают
(уменьшают) количество тест-микроба, вносимого в питательную среду, с целью достижения оптималь
ного размера диаметра зон задержки роста тест-микроба.
5.5.2.3 Построение градуировочного графика для определения активности гризина
Для построения градуировочного графика из раствора, содержащего 10 ЕД в 1см3, готовят 5 рас
творов концентрациями 1.8; 2.4; 3.0; 3.8; 4.5 ЕД с 1 см3. Раствор, содержащий 3 ЕД в 1 см3, является
контрольным.
Полученные стандартные растворы, за исключением контрольного, капельницей вносят в 3 лунки
(по 3 чашки на каждую концентрацию). Контрольный раствор вносят в остальные 3лунки всех 15чашек.
Обьем вносимых растворов (стандартного и контрольного) должен быть равным и составлять около
0.1 см3. Перед работой капельницу тщательно ополаскивают буферным раствором, а затем раствором,
который следует вносить в каждую лунку. Чашки выдерживают в течение 16-18 ч в термостате при тем
пературе 37°С, затем измеряют диаметры зон задержки роста тест-культуры.
8