ГОСТ Р 57244—2016
Растворы А и Б готовят следующим образом:
- раствор А — 22.6 г цитратадигидрата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3
и доливают воду до метки;
- раствор Б — 8.2 см3концентрированной соляной кислоты помещают в мерную колбу вместимо
стью 1000 см3и разбавляют водой до метки.
Растворы для окраски по Граму.
Вода мясная по ГОСТ 20729.
Бульон мясо-пептонный (МПБ) по ГОСТ 20730.
Среда агаровая голодная; готовят следующим образом:
- 15 г агара, взвешенного с погрешностью не более 0.01 г. помещают в колбу вместимостью
1000 см3, содержащую 900 см3 воды. Колбу ставят на водяную баню и нагревают до полного
расплавления агара;
- 3 г дигидроортофосфата калия, взвешенного с погрешностью не более 0.01 г. растворяют в 100
см3воды, затем выливают в расплавленный агар, доводят объем водой до 1000 см3и пере
мешивают. Устанавливают pH 8,0 при помощи 30 %-ного раствора гидрооксида натрия. Агаровую
среду кипятят до образования осадка, затем фильтруют через толстый слой ваты и стерилизуют
в автоклаве в течение 30 мин при температуре (110 ± 1) °С. pH среды поля стерилизации должна
быть 7.8—8.0. Среду хранят при температуре 20—22 °С не более двух месяцев.
Среда агаровая питательная; готовят аналогично приготовлению агаровой голодной среды, при
этом взамен воды берут МПБ с содержанием аминного азота 50-60 мг в 100 см3бульона. Питательную
среду стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при температуре (110± 1) СС. После стерилизации pH
раствора должна быть 7.8—8,0. Раствор хранят в течение месяца при комнатной температуре.
Раствор физиологический.
Агар мясо-пептонный (МПА) — среда для культуры Вас. subtilis 6633; готовятследующим образом;
МПБ разбавляют водой в соотношении 1 ; 2. К 1000 см3разбавленного МПБ добавляют 20 г агара, взве
шенного с погрешностью не более 0,01 г. Для набухания агара смесь выдерживают в течение 40—
60 мин при комнатной температуре.
МПА расплавляют на водяной бане, устанавливают pH 7.2—7.4 при помощи 30 %-ного раствора
гидрооксида натрия, дают среде отстояться в течение 30 мин. после чего среду фильтруют через тол
стый слой ваты, затем разливают в колбы и стерилизуют при температуре (110 ± 1)°С в течение 30 мин.
pH среды после стерилизации должен быть 7,2—7.4.
Среду для выращивания спор Вас. subtilis 6633 в матрицах готовят следующим образом:
25 г агара, взвешенного с погрешностью не более 0.01 г. добавляют на 1000 см3бульона Хоттин-
гера с содержанием 30-35% аминного азота. Полученную среду разливают по матрицам и стерилизуют
в течение 30 мин при температуре (110±1)°С. pH после стерилизации должен быть 6.0—6.2.
Суспензия тест-культуры Вас. subtilis 6633 готовят следующим образом:
тест-культуру Вас. subtilis 6633 переносят микробиологической петлей в пробирку с физиологиче
ским раствором, затем пипеткой каплю полученной суспензии переносят вчашки Петри со средой МПА.
растирают ее по чашке стеклянным шпателем, после чего этим же шпателем переносят оставшуюся
на ном культуру из чашки в чашку с вышеуказанной средой путем растирания (5-7 чашек), добиваясь
таким образом в последующем роста отдельных характерных колоний.
Тест-культуру выращивают при температуре 37 °С в течение 18—24 ч. Затем отбирают типичные
колонии — мелкие, сероватые с зубчатым краем. — и пересевают бактериальной петлей на скошенный
МПА в пробирку и выращивают при температуре 37 вС в течение 18 ч. после чего культуру со скошен ного
агара смывают 5-10 см3стерильной дистиллированной воды и смыв переносят в матрацы. Засе янный
матрац выдерживают при температуре 37 еС в течение 5—7 сут, после чего производят микро
скопический контроль и, если в мазках, окрашенных по Граму. имеется в поле зрения 80 %— 90 % спор,
делают смыв культуры стерильной дистиллированной водой.
Полученную взвесь спор прогревают при температуре 60 °С — 70 °С на водяной бане в течение
30 мин. затем взвесь спор промывают не менее трех раз стерильной дистиллированной водой при
центрифугировании до полной прозрачности надосадочной жидкости. Промытую взвесь спор хранят в
стерильной дистиллированной воде в запаянных ампулах или пробирках в течение двух лет при
тем пературе от 4 °С до 10 °С.
Гризина основной стандартный раствор концентрации 1000 ЕД в 1 см3; раствор готовят следу
ющим образом: 20 мг стандартного образца гризина. взвешенные с погрешностью не более 0.0002 г.
растворяют в рассчитанном объеме раствора соляной кислоты концентрации 0,01 моль/дм3.
7