ГОСТ Р 57201—2016
Затем суспензию кипятят в течение 20 мин на водяной бане или помещают в автоклав на 15 мин
при давлении 0,5—1.0 кгс/см2, после чего охлаждают.
Охлажденную суспензию переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят pH до 6.8—
7.0 добавлением 0.5 н. раствора едкого натра и 1 н. раствора соляной кислоты и доливают колбу дис
тиллированной водой до метки.
Смесь фильтруют через бумажный фильтр и часть профильтрованного экстракта разбавляют во
дой до такой концентрации, чтобы в 1 см3содержалось приблизительно 0,02—0.05 мг витамина В,2.
5.5.2.7 Приготовление контрольной пробы
В исследуемой пробе может содержаться метионин, к которому чувствителен штамм Е. coli 113-3,
поэтому проводят контрольный анализ исследуемого экстракта, где витамин В12предварительно разру
шают.Для этого 5 см3экстракта смешивают с 5 см3 0,2 н. едкого натра и кипятят в течение 20 мин на во
дяной бане с обратным холодильником. После охлаждения раствор нейтрализуют добавлением 1 н. со
ляной кислоты иразбавляют водой до такой же степени, как и в опыте с неразрушенным витамином В,2.
5.5.2.8 Приготовление разведений исследуемого раствора кормового витамина В12
Из исследуемой пробы готовят три разведения (в двух повторностях каждое), для чего в 6 про
бирок (по две для каждого разведения) вносят по 5 см3основной среды и следующие количества экс
тракта: 0.5; 1.0: 2,0 см3. Кроме того, готовят три разведения контрольного раствора. Для этого в три
пробирки вносят по 5 см3основной среды и следующие количества контрольного раствора; 3; 4; 5 см3.
Затем объем содержимого кахщой пробирки доводят до 10 см3добавлением дистиллированной воды.
5.5.3 Проведение испытания
Испытание состоит из составления калибровочной линии для чистого витамина В12 и непосред
ственного испытания исследуемой пробы.
Пробирки с разведением стандартного иисследуемого растворов помещают в автоклав на 20 мин при
давлении 1 кгс/см2. после чего охлаждают. Затем засевают каждую пробирку одной каплей бактериальной
суспензии (приготовленной по п. 5.5.2.4) и ставят в термостат на 20—24 ч при температуре 37 °С.
По истечении указанного времени пробирки прогревают в автоклаве текучим паром 15мин и охлажда
ют. После охлаждения содержимое пробирок взбалтывают и измеряют мутность на фотоэлектроколориме
тре или нефелометре. При использовании фотоэлектроколориметра замеры делают присинем светофиль
тре. Контрольным раствором для определения мутности является дистиллированная вода.
По полученным данным на миллиметровой бумаге строят калибровочный график. На оси ординат
откладывают значение мутности для каждого стандартного разведения (среднее из трех пробирок), а на
оси абсцисс соответствующее количество витамина В12. При соединении полученных точек полу чают
калибровочную линию.
При незначительном разбросе точек калибровочную линию проводят между ними на расстоянии,
равноудаленном от большинства точек.
5.5.4 Обработка результатов
Содержание витамина В12 определяют отдельно в каждой пробирке исследуемой пробы при по
мощи калибровочной линии. Данные, которые не укладываются в калибровочную линию, отбрасывают.
По данным, которые уложились в линию (не менеедвух разведений), определяют количество витамина
В12 в исследуемой пробе, затем вычисляют среднее арифметическое результатов двух разведений.
Если наблюдается рост бактерий в контрольных пробирках, где витамин разрушен, то находят по
калибровочному графику соответствующие росту значения, которые вычитают из найденного количе
ства витамина В12в исследуемой пробе.
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух
параллельных определений.
Допускаемые расхождения между результатами двух параллельных определений не должны пре
вышать 4.5 отн. %. Погрешность метода — ±15 %.
П р и м е ч а н и е — При разногласиях между поставщиками и потребителем и при поставке продукции на
экспорт определение массовой доли витамина В12 проводят с использованием цианистого калия.
5.6 Определение безвредности
5.6.1 Аппаратура и реактивы
Для проведения испытания применяют:
- шприц медицинский инъекционный типа «Рекорд» по ГОСТ 22967;
- ступку по ГОСТ 9147;
- воду питьевую по ГОСТ Р 51232.
7