ГОСТ 33774—2016
для установления LCS0. Если планшет полностью удаляют из испытания, то возможность оценить и
определить видимые эффекты может стать более затруднительной, особенно если удаленный план
шет представляет планшет с контролем на растворитель или планшет, в котором также подвергаются
воздействию обработанные эмбрионы. В первом случае испытание необходимо повторить. Во втором
случае потеря целой группы(групп) обработки из-за гибели во внутреннем контроле в планшете может
ограничить возможность оценки эффектов и определения значения 1_С50.
7.3.2 Положительный контроль, в качестве которого используют 3,4-дихлоранилин в определен
ной концентрации 4 мг/л. проводят с каждой партией икры, используемой для испытания.
7.3.3 В случае использования растворителя дополнительную группу из 20 эмбрионов подвергают
воздействию растворителя в отдельном 24-луночном планшете, обеспечивая, таким образом, контроль
на растворитель. Чтобы испытание считалось приемлемым, должно быть показано, что растворитель
оказывает незначительный эффект на вылупление, выживаемость или не оказывает других отрица
тельных эффектов на эмбрионы (см. 5в).
7.4 Начало воздействия и продолжительность испытания
7.4.1 Испытание начинают сразу же после оплодотворения икры и прекращают через 96 ч воздей
ствия. Эмбрионы должны быть погружены в испытуемые растворы до начала деления зародышевого
диска или самое позднее до 16-клеточной стадии. Для начала воздействия с минимальной задержкой,
по меньшей мере удвоенное количество икры, необходимое для каждой группы обработки, отбирают
произвольно и переносят в соответствующие концентрации и контроля (например, в кристаллизацион
ные чашки емкостью 100 мл; икра должна быть полностью покрыта) но позднее чем через 90 мин после
оплодотворения.
7.4.2 Жизнеспособная оплодотворенная икра должна быть отделена от неоллодотворенной икры и
перенесена в 24-луночные планшеты, предварительно кондиционированные в течение 24 ч и вновь на
полненные свежеприготовленными испытуемыми растворами из расчета 2 мл/лунку в точение 180 мин по
сле оплодотворения. С помощью стереомикроскопа (предпочтительно £ 30-кратное увеличение) отбирают
оплодотворенную икру, подвергшуюся делению и не показывающую никаких явных нарушений деления
(например, асимметрию, формирование пузырьков) или повреждений хориона. Рекомендации по отбору и
распределению икры на группы см. приложение Б. рисунки Б.1 и Б.З и приложение В. рисунок В.2.
7.5 Распределение икры по 24-луночным планшетам
Икру распределяют в лунки планшетов в следующем количестве (см. приложение В, рисунок В.1)
- 20 икринок на один планшет для каждой испытуемой концентрации;
- 20 икринок в качестве контроля на растворитель на один планшет (при необходимости);
- 20 икринок в качестве положительного контроля на один планшет;
- 4 икринки в воде для разведения в качестве внутреннего контроля в планшете на каждый из
вышеперечисленных планшетов:
- 24 икринки в воде для разведения в качестве отрицательного контроля на один планшет.
7.6 Наблюдения
7.6.1Основные наблюдения, проводимые за каждым испытуемым эмбрионом, включают следу
ющие показатели: коагуляция, отсутствие формирования сомитов, неотделение хвоста, а также от
сутствие сердцебиения (таблица 1). Данные наблюдения используют для определения гибели: любой
положительный результат в одном из данных наблюдений означает, что эмбрион данио-рерио погиб.
Кроме того, ежедневно регистрируют уровень вылупления в обработанной и контрольной группах, на чиная
с 48 ч. Наблюдения регистрируют каждые 24 ч до окончания испытания.
Т аб лиц а 1 — Основные наблюдения по острой токсичности на эмбрионах данио-рерио на 24-96 ч после опло
дотворения
Время воздействия
24 ч48 ч72 ч9в ч
Коагулированные икринки
++♦+
Отсутствие формирования сомитов
++++
6