ГОСТ 33538—2015
при напряжении 400 В и максимальной мощности тока 8 Вт. конечное напряжение — 1700 В. При раз
мерах пластины геля 5.0 * 4,5 см — 3 мА. 70 В. 3.5 Вт и 2000 В соответственно. Продолжительность
разделения при использовании пластины разделяющего геля размерами 12.5 х 25.0 см и расстоянии
между электродами 10 см — 2 ч. размерами 5.0 * 4,5 см — 30 мин.
В конце разделения полоса белка-маркера ИЭТ цитохрома с должна уйти из разделяющего геля
или остаться на краю у катода (в зависимости от типа и фракции используемых амфолитов-носителей).
5.4.2 После ИЭФ на тыльной стороне пластины разделяющего геля фломастером отмечают по
зиции белков-маркеров ИЭТ.
5.4.3 Из приготовленных по 5.3.3 глютениновых реплик вырезают фрагменты, приблизительно
соответствующие по размерам зоне градиента от 6.0 до 8,0 ед. pH в разделяющем геле, которая на
чинается на пластине разделяющего геля размерами 12.5 * 25.0 см в 4 см от позиции миоглобина в
сторону анода и заканчивается в 1 см в сторону катода, на пластине разделяющего геля размерами 5.0
* 4.5 см — в 2,5 и 0.5 см соответственно.
5.4.4 При использовании реплики с тонким слоем глютенина. нерастворимого в уксусной кислоте,
ее смачивают дистиллированной водой, накладывают белковой стороной на пластину разделяющего
геля, находящуюся на терморегулируемом столике прибора для электрофореза, отмечают на ней со
стороны пластиковой подложки позиции белков-маркеров ИЭТ. Затем накрывают пластину разделяю
щего геля и глютениновую реплику пластиковой пленкойдля предотвращения высыхания и инкубируют
на терморегулируемом столике прибора для электрофореза или в термостате в течение 30—50 мин
при температуре 37 °С.
Затем снимают глютениновую реплику, погружают ее в уксусную кислоту на 10 мин для раство
рения частично гидролизованного глютенина. переносят в дистиллированную воду или Трмс-HCI буфер и
добавляют несколько капель раствора йода. За счет следов крахмала, оставшихся в слое глютенина
после отмывки, глютениновая реплика темнеет, за исключением зон. гидролизованных протеиназой.
Протеиназам соответствуют прозрачные полосы на темном фоне. Глютениновую реплику фотографи
руют в проходящем свете.
5.4.5 В случае использования глютениновой реплики со слоем растворимого в уксусной кислоте
глютенина ее смачивают в трис-HCI буфере, убирают фильтровальной бумагой излишек жидкости, на
кладывают на пластину разделяющего геля, накрывают пластину разделяющего геля и глютениновую
реплику пластиковой пленкой и инкубируют на терморегулируемом столике прибора для электрофоре за
или в термостате в течении 40—60 мин при температуре 37 °С.
Затем снимают глютениновую реплику, погружают в трис-HCI буфер и через 10 мин фотографиру
ют в рассеянном свете (источник света расположен сбоку снизу). Протеиназам соответствуют опалес
цирующие полосы на темном фоне.
Контрастность компонентов, соответствующих протеиназам. может быть повышена погружением
сфотографированной глютениновой реплики в дистиллированную воду или краткосрочным (в течение 5
с) погружением глютениновой реплики в уксусную кислоту по 5.3.1.3 с последующим переносом в бу фер
Трис-HCI. В этом случае более эффективным может оказаться фотографирование в проходящем свете.
5.4.6 Одновременно проводят параллельный анализ контрольных проб в соответствии с 5.4.1—
5.4.5.
5.5 Обработка результатов
Просматривают сфотографированную глютениновую реплику. Протеиназам клопов-черепашек
соответствуют полосы с ИЭТ в интервале от 6.0 до 7,5 ед. pH. при этом наиболее заметные компонен ты
имеют ИЭТ около 7.0 ед. pH. В неповрежденных зернах компоненты протеиназ не выявляются. Для
подтверждения результатов анализа сравнивают полосы ИЭТ анализируемой пробы с контрольной.
При более высокой чувствительности и разрешающей способности анализа (число выявляемых
комопонентов протеиназ), достигаемых использованием реплики с тонким слоем растворимого в уксус
ной кислоте глютенина. могут выявляться внутривидовые и межвидовые отличия повреждавших зерно
клопов рода Eurygasterпо компонентному составу гидролизующих глютенин протеиназ.
Полосы с ИЭТ вне интервала pH от 6.0 до 7,5 ед. pH могут свидетельствовать о присутствии в
зерне протеиназ других видов насекомых или микроорганизмов.
5