ГОСТ 33538—2015
5.3.2 Подготовка анализируемой пробы
Л
абораторную пробу, состоящую из зерен массой 1.00 г. размалывают в ступке. Из полученной
муки отбирают анализируемую пробу массой 50 мг. помещают ее в пластиковую пробирку вместимо
стью 0.5 см3, добавляют к ней пятикратный объем детергента, перемешивают и оставляют в течение
20 мин при комнатной температуре для экстракции белковых фракций, содержащих протеиназы. В
ка честве контроля используют один-два образца зерна, заведомо поврежденного клопами-черепашками.
Полученную смесь центрифугируют в течение 2 мин. осадок отбрасывают. Для концентрирования
белков к надосадочной жидкости добавляют пятикратный объем ацетона, выдерживают в холодильной
камере в течение 10 мин и центрифугируют. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок растворя ют
в объеме детергента, эквивалентном массе анализируемой пробы.
Срок хранения анализируемой пробы при температуре 4 °С — не более двух дней.
При необходимости длительного хранения полученной анализируемой пробы к ней добавляют
равный объем глицерина.
Срок хранения анализируемой пробы с глицерином при температуре от минус 24 °С до минус
80 °С — не более двух лет.
5.3.3 Приготовление глютониновых реплик
5.3.3.1 К 150 г муки или препарата клейковины добавляют 300 см30.2 %-ного NaCI. через 30 мин
центрифугируют и отмывают клейковину в струе водопроводной воды. Полученную сырую клейковину
массой 30 г измельчают вручную, добавляют 100 см3 70 %-ного этилового спирта и помещают на маг
нитную мешалку на 30 мин и центрифугируют (процедуру экстракции спиртом повторяют трижды для
удаления большей части глиадинов).
К 40 г сырой разбухшей клейковины добавляют 150 см3 уксусной кислоты по 5.3.1.3 и помещают
колбу на роторную качалку на 2 ч. Затем полученную суспензию центрифугируют в течение 10 мин при
10000р. Надосадочную жидкость, преимущественно содержащую фракцию РУКГт-1.сохраняют. Косад ку
снова добавляют уксусную кислоту по 5.3.1.3 и повторяют процедуру перемешивания и центрифуги
рования два раза, получая фракции РУКГт-2 и РУКГт-3 в надосадочной жидкости. Оставшийся осадок
используют для приготовления реплик, содержащих слой НРУКГт.
5.3.3.2 Для получения тонкого слоя НРУКГт к 7.5 г осадка глютенина в колбе, полученного по
5.3.3.1. добавляют 22.5 см3 уксусной кислоты по 5.3.1.3 и ставят колбу на роторную мешалку до полу
чения гомогенной суспензии.
5.3.3.3 На установленный горизонтально терморегулируемый столик прибора для электорфореза
помещают пластиковую подложку гидрофильной стороной кверху. На подложку равномерно наливают
суспензию глютенина НРУКГт no 5.3.3.2. доводят температуру до 50 °С и выдерживают до полного вы
сыхания суспензии. В результате на подложке образуется равномерный тонкий белый непрозрачный
слой НРУКГт.
5.3.3.4 Для получения тонкого слоя РУКГт-1, РУКГт-2 или РУКГт-3 30 см3соответствующего рас
твора по 5.3.3.1 также разливают по поверхности подложки и высушивают в соответствии с 5.3.3.3. В ре
зультате получают пластину с прозрачным тонким слоем растворимого в уксусной кислоте глютенина.
5.3.3.5 Срок хранения глютениновых реплик с НРУКГт и РУКГт при комнатной температуре — не
более одного и шести месяцев соответственно.
5.4 Проведение анализа
5.4.1Фракционирование белков методом ИЭФ проводят на пластине разделяющего геля с по
мощью прибора для горизонтального электрофореза.
Сначала по краям пластины разделяющего геля накладывают электродные полоски, смоченные
анодным и катодным буферами.
На пластину разделяющего геля на расстоянии 1 см от анода накладывают в ряд (по шаблону,
помещенному под пластину с гелем) полоски фильтровальной бумаги размерами 5.0 * 1 .0 * 0,5 мм
(ориентированные вдоль направления фракционирования) с интервалом 1.5 мм. Затем пипеткой на них
наносят по 2.5 мкм3 анализируемой пробы по 5.3.2. На крайние полоски, а также каждые кратные по
счету пятые или десятые полоски наносят раствор белков-маркеров ИЭТ. На пластину разделяющего
геля с анализируемыми пробами и белками-маркерами ИЭТ накладывают крышку с электродами ано
дом на электродную полоску, смоченную анодным буфером, катодом — катодным буфером.
На одной пластине разделяющего геля размерами 12.5 * 25.0 см анализируют до 45 проб, вклю
чая белки-маркеры ИЭТ. При расстоянии между электродами 10 см начальный ток должен быть 20 мА
4