ГОСТ 33640—2015
Приложение Г
(рекомендуемое)
Метод культивирования Lumbriculus variegatus
Lumbriculus variegatus (Muller, 1774). Lumbriculidae. Oligochaeta являются обитателями пресноводных отло
жений и широко используются в качестве модели в экотоксикологических испытаниях. Они легко культивируются в
лабораторных условиях. Схема методов культивирования приводится ниже.
Методы культивирования
Условия культивирования Lumbriculus vanegatus подробно изложены в (3]. [5]. [7], [27]. Краткое описание этих
условий приведено ниже. Основным преимуществом L. variegatus является их быстрое размножение, что обеспе
чивает быстрый рост биомассы лабораторной культивируемой популяции [3]. [5]. [7].
Червей культивируют в крупных аквариумах с длиной 16 : шириной 8 (57-80 л) при температуре 23 °С и све
товом периоде (100-1000 лк) с использованием ежедневно обновляемой природной воды (45-50 л на аквариум).
Субстрат готовят, разрезая неотбеленные оберточные бумажные полотенца на полоски, которые затем смешивают с
водой, предназначенной для использования при культивировании, в течение нескольких секунд до получения
мелких кусочков бумажного субстрата. Этот субстрат используют непосредственно в аквариумах для культивиро
вания Lumbriculus. покрывая нижнюю часть резервуара или сохраняя замороженным в деионизированной воде
для последующего использования. Внесенный в резервуар субстрат обычно сохраняется в течение примернодвух
месяцев.
Каждая культура червей начинается с 500-1000 червей, которым скармливают 10 мл суспензии, содержащей
6 г стартового корма на основе форели, три раза в неделю при обновляемых или проточных условиях. Статические
или полустатические культуры должны получить меньшее количество корма для предотвращения бактериального и
грибкового роста.
В этих условиях количество особей в культуре обычно удваивается примерно через каждые 10-14 сут.
Альтернативно Lumbriculus variegatus также можно культивировать в системе, состоящей из слоя кварцевого
песка, используемого для искусственного осадка (высотой 1-2 см), и восстановленной воды. В качестве сосудов
для культивирования используют контейнеры из стекла или нержавеющей стали высотой от 12 до 20 см. Водную
массу слегка аэрируют (например, 2 пузырька в секунду) с помощью пипетки Пастера, зафиксированной примерно на
2 см выше поверхности осадка. Для предупреждения накопления, например аммиака, надосадочную воду не
обходимо менять, используя проточную систему или не менее одного раза в неделю вручную. Олигохет выдержи
вают при комнатной температуре со световым периодом 16 ч света (интенсивность 100-1000 лк) и 8 ч темноты. В
лолустатических культурах (обновление воды раз в неделю) червям скармливают корм TetraMin два раза в неделю
(например, 0.6-0.8 мг на см2 поверхности осадка), применяя в виде суспензии 50 мг TetraMin на мл деионизиро
ванной воды.
Lumbriculus variegatus отбирают из культуры, например переносом субстрата на сито с мелкими отверсти
ями или самих червей с использованием оплавленной стеклянной широкогорлой пипетки (диаметр около 5 мм) в
отдельный стакан. Если переносили субстрат в химический стакан, то химический стакан, содержащий червей и
субстрат, оставляют на ночь в проточных условиях, что позволит удалить субстрат из стакана, в то время как черви
останутся в нижней части сосуда. Затем их помещают в другие подготовленные резервуары для культивирования
или подвергают дальнейшей подготовке для проведения испытания согласно [3] и [4] или приведенному ниже.
Проблема, которая является критической при использовании Lumbriculus vanegatus в испытаниях осадка,
заключается в способе размножения (архитомия или морфаллаксис [6]). Это бесполое размножение приводит к
появлению двух фрагментов, не принимающих пищу в течение определенного периода до развития головной или
хвостовой частей [7]. [8]. Это означает, что воздействие на Lumbriculus variegatus через заглатывание обогащенного
осадка не происходит непрерывно.
Таким образом, синхронизация проводится для минимизации неконтролируемого размножения и регенера
ции и за счет этого последующей высокой вариабельности результатов испытаний. Такая вариабельность может
иметь место, если некоторые особи фрагментированы и поэтому не потребляют корм в течение определенного пе
риода времени, и они менее подвержены воздействию испытуемого вещества по сравнению с особями, которые не
фрагментированы на время испытания {Э]—[11]. За 10-14 сут до начала испытания черви должны быть
искусствен но фрагментированы (синхронизованы). Для синхронизации отбираются крупные черви
(половозрелые особи), которые предпочтительно не имеют признаков недавнего морфаллаксиса. Этих червей
помещают на предметное стекло в каплю воды для культивирования и рассекают скальпелем в средней части
тела. Следует обратить вни мание. чтобы задние концы имели одинаковый размер. Затем задние концы оставляют
до регенерирования нового головного конца в сосудах для культивирования, содержащих тот же субстрат,
который используется в культуре, и восстановленную воду до начала испытания. На регенерацию новых
головных концов указывает зарывание
17