ГОСТ Р 52173-2003
6.2.6 Смеси, приготовленные по 6.2.5, центрифугируют 6 мин при частоте вращения
12000 мин-1при комнатной температуре. Аккуратно удаляют надосадочную жидкость. Каждый
осадок 2—3 раза промывают 200 мм370 %-ного этилового ректификованного спирта, приготовлен
ного по 6.1.7, каждый раз перемешивая осадки на аппарате для встряхивания 15—20 с и центрифу
гируя их на микроцентрифуге 6 мин при частоте вращения 12000 мин-’. Тщательно (до последней
капли) удаляют надосадочную жидкость.
6.2.7 Осадки, приготовленные по 6.2.6, растворяют в 50—100 мм1деионизированной воды и
получают раствор ДНК.
Растворы ДНК, приготовленные по 6.2.7, непосредственно используют для проведения ПНР
или хранят при температуре минус 20 *С сроком до одного года в морозильной камере.
6.3 Приготовление реакционных смесей № 1 и № 2
6.3.1 Приготовление реакционной смеси N° 1 на пять проб
В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1.5 см3, помещенную в кювету со льдом, вно
сят 312,5 мм3деионизированной воды, 52.5 мм3 10 буфера для Г1ЦР с хлоридом магния по 4.38,
117|. 26 мм3 смеси нуклеотидов, приготовленной по 6.1.9, 13 мм3 праймера на промотор J5S-1
(концентрацией 20 мкмоль/дм3) по 4.44. |26|, 13 мм3 праймера на промотор 355-2 (концен
трацией 20 мкмоль/дм3) по 4.44, |26J, 2,5 мм’ фермента Taq-полимеразы (концентрацией 5 ед/мм5)
по 4.37,116]. 52,5 мм1раствора БСА. приготовленного по 6.1.8. Смесь перемешивают 5 с на аппарате
для встряхивания, не допуская образования пены или пузырьков.
6.3.2 Приготовление реакционной смеси N° 2 на пять проб
В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см3, помещенную в кювету со льдом, вно
сят 312,5 мм* деионизированной воды, 52.5 мм3 10 буфера для ПЦР с хлоридом магния. 26 мм3
смеси нуклеотидов, приготовленной по 6.1.9. 13 мм3праймера на терминатор was-1(концентра
цией 20 мкмоль/дм3) по 4.45. (27), 13 мм3 праймера на терминатор HOS-2 (концентрацией
20 мкмоль/дм3) по 4.45, |27|, 2,5 мм3фермента Taq-полимеразы (концентрацией 5 ед/мм5), 52,5 мм3
раствора БСА, приготовленного по 6.1.8. Смесь перемешивают 5 с на аппарате для встряхивания, не
допуская образования пены или пузырьков.
6.3.3 Реакционные смеси № I и № 2, приготовленные по 6.3.1 и 6.3.2, центрифугируют на
настольной микроцентрифуге 30 с при частоте вращения 3000 мин-’. Реакционную смесь Ns 1раз
ливают по 90 мм3в пять микроцентрнфужных пробирок вместимостью 0,2 см3(или 0.5 см3в зависи
мости от типа используемого амплификатора) для проведения IIЦР. Реакционную смесь № 2 разли
вают по 90 мм3в пять других микроцентрнфужных пробирок вместимостью 0,2 см3(или 0,5 см3в
зависимости от типа используемого амплификатора) для проведения ПЦР. Реакционные смеси № I и
№ 2 готовят непосредственно перед проведением Г1ЦР.
7 Проведение анализа
7.1В первые две пробирки с реакционной смесыо № I и в первые две пробирки с реакционной
смесью № 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК. выделенной из анализиру
емого продукта, приготовленный по 6.2.1.1—6.2.1.7, по 2 мм3в каждую.
В третью пробирку с реакционной смесью № I и в третью пробирку с реакционной смесыо
№ 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК. выделенной из стандартного образ
ца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения
(Certified Reference Material IRMM № 410R SB-0), no 2 мм’ в каждую.
В четвертую пробирку с реакционной смесыо № I и в четвертую пробирку с реакционной
смесыо № 2добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК. выделенной из стандартно го
образца состава генетически модифицированного источника пиши растительного происхожде ния
(Certified Reference Material IRMM № 4I0R SB-5), no 2 мм1в каждую.
В пятую пробирку с реакционной смесью № I и в пятую пробирку с реакционной смесью
№ 2 автоматическим микродозатором добавляют деионизированную воду по 2 мм3 в каждую —
холостой опыт.
7.2 В каждую пробирку со смесью по 7.1 добавляют, не перемешивая, по одной капле
(20—40 мм3) вазелинового масла по ГОСТ 3164.
7.3 Пробирки со смесями, подготовленными по 7.2, помещают в амплификатор для проведе
ния ПЦР. Программа амплификации для праймеров на промотор 35S приведена в таблице 1, на
терминатор nos —в таблице 2.
6