ГОСТ ISO 22119-2013
6 Реактивы и материалы
6.1 Общие положения
В ходе анализа, если не указано иное, используют только реагенты, признанные чистыми для
анализа, и стерильную дистиллированную или деминерализованную воду или воду эквивалентной
чистоты, свободную от нуклеиновых кислот и нуклеаз, подходящие для молекулярного
биологического анализа.
Не допускается использование любых реагентов или расходных материалов, например,
компонентов обогащенных бульонов, флуоресценциякоторых интерферирует с системой
обнаружения.
Особые требования применяются к реагентам, указанным в пунктах 6.2-6.6.
6.2 ДНК-полимераза и реакционный буфер
6.2.1 ДНК-полимераза
Термостабильнаяполимераза(возможно,сактивностьюобратнойтранскриптазы),
используемая для ПЦР. Она должна быть использована в соответствии с указаниями производителя.
П р и м е ч а н и е - Она может быть очищенной, в виде нативного фермента, или очищенной, генетически
модифицированной рекомбинантной формой фермента.
Если будут использоваться зонды гидролиза. ДНК-полимераза должна обладать 5’-3’-
экзоиуклеазной активностью. Для анализа РНК требуется смесь обратной транскриптазы и
ферментов ДНК-полимеразы или ДНК-полимераза с активностью обратной транскриптазы.
Каждая ДНК-полимераза может требовать различных экспериментальных условий.
6.2.2 Реакционный буфер
Реакционный буфер должен соответствовать требованиям, изложенным в ISO 20838.
6.3 Дезоксирибонуклеотид трифосфаты (dNTPs) для ПЦР
dNTPs должны соответствовать требованиям, изложенным в ISO 20838.
6.4 Праймеры
Праймеры должны соответствовать требованиям, изложенным в ISO 20838.
6.5 Флуоресцентные зонды для обнаружения в режиме реального времени
Олигонуклеотиды должны быть надлежащего качества и должны быть предназначены для
обнаружения последовательности, присущей специфическому ПЦР-продукту. Последовательность
зонда должна быть высоко комплиментарна целевой последовательности ДНК.
6.6 Внутренний контроль амплификации
Эффективность амплификации тестового образца может быть проверена с помощью фрагмента
ДНК контроля, добавленного в ту же реакционную емкость, что и эксрагированная ДНК из тестового
образца. Также возможно использовать те же пары праймеров для амплификации фрагмента
контрольной ДНК. как и для амплификации целевой ДНК (гомологичный внутренний контроль
амплификации) или другую пару праймеров (гетерологичный внутренний контроль амплификации).
Система с целевым геном и система с внутренним контролем амплификации должны в результате
показать приблизительно равную эффективность амплификации. Концентрация добавленного
фрагмента контрольной ДНК должна быть как можно более низкой, чтобы обнаружить даже
небольшое ингибирование и в то же время дать статистически воспроизводимый положительный
результат. Далее, должно быть установлено, что внутренний контроль амплификации не влияет на
уровень обнаружения целевого гена.
Следующие положения снижают риск негативных влияний на уровень обнаружения:
- эффективность амплификации гомологичного внутреннего контроля амплификации несколько
ниже, чем целевой ДНК;
- снижение концентрации праймеров для гетерологичного внутреннего контроля амплификации.
Контроль внутренней амплификации может добавляться в образцы на ранней стадии анализа,
и. следовательно, в то же время выступать в качестве контроля процедуры экстракции.
6.7 Реагенты для предотвращения механической контаминации
Реагенты дляпредотвращения механическойконтаминации должнысоответствовать
требованиям, изложенным в ISO 20838.
7 Оборудование
7.1 Общие положения
Оборудование должно соответствовать требованиям, изложенным в ISO 22174.
В лаборатории используютоборудование, содержащееся в надлежащем состоянии и
подходящее для методов исследования.
5