ГОСТ ISO 22119-2013
7.2 Специальные приборы и оборудование
В дополнение к обычному лабораторному оборудованию, а также оборудованию, указанному в
ISO 22174. используют следующие аппараты.
7.2.1 Термоциклер, оснащенный:
a) источником энергии, подходящим для возбуждения флуоресцентных молекул;
b
) оптическойсистемойобнаружениядляобнаруженияфлуоресцентныхсигналов,
генерируемых в процессе ПЦР.
Применение системы внутреннего контроля требует использования инструментов, способных
обнаружить сигналы различных длин волн.
7.2.2 Реакционные емкости и крышки или затворы, которые могут многократно
нагреваться до температуры 100 °С и охлаждаться до 4 С без повреждений и не влияющие на
сигнал флуоресценции, генерируемый в процессе амплификации.
8 Лабораторная проба
Экстракты, содержащие нуклеиновые кислоты из любой пробы, соответствующего области
применения, могут использоваться в качестве лабораторных проб при условии отсутствия видимого
ингибирования ПЦР и помех флуоресценции.
9 Процедура
9.1 Пробоподготовка
Экстракция нуклеиновых кислот и/или очистка тестового образца должны осуществляться в
соответствии с методом, изложенным в ISO 20837 [1].
В результате, раствор нуклеиновых кислот должен содержать достаточное количество целевой
нуклеиновой кислоты достаточно высокого качества так. чтобы для качественного анализа от одного до
10 целевых микроорганизмов или эквивалентов вирусных геномов были определены в тестовой
пробе. Обогащение и^или концентрация целевого микроорганизма или вируса обычно требует для
качественного анализа небольшое число целевых организмов в тестовой порции.
В результате раствор нуклеиновых кислот должен содержать вещества, которые не ингибируют
ПЦР. не создают помех для флуоресценции.
П р и м е ч а н и е - Флуоресценция зачастую происходит из окрашенных реакционных емкостей и
некоторых ингредиентовобогащенныхбульонов.
Количественный анализ требует процедуры подготовки образцов, гарантирующей, что
количество нуклеиновых кислот целевых микроорганизмов или вирусов в конечном растворе
нуклеиновых кислот высоко воспроизводимое.
9.2 Амплификация
9.2.1 Общие положения
Амплификация специфических нуклеиновых кислот осуществляется in vitro с помощью реакции,
катализируемой ДНКполимеразой в присутствии олигонуклеотидов, праймеров, дезоксимуклеозид
трифосфатов и флуоресцентных зондов в определенном буфере реакции.
В дополнение к стандартной ПЦР. при постановке реакционной смеси необходимо избегать
использования цветных наконечников и реакционных емкостей. Следует принять меры для
предотвращения контаминации частицами пыли вне реакционных сосудов.
Сигнал флуоресцентного зонда контролируется на протяжении всего процесса амплификации.
РНК может быть обнаружена с помощью ПЦР в реальном времени, если последовательность
была изначально транскрибирована в комплементарную последовательность ДНК с помощью
обратной транскрипции.
9.2.2 Параметры циклеров
9.2.2.1 Зонды гидролиза
В целом, процесс амплификации использует протокол двухступенчатого цикла с денатурацией и
комбинированными праймерами и зондами отжига и шагом элонгации. Флуоресцентный сигнал
контролируется на протяжении отжига и шага элонгации.
9.2.2.2 Зонды гибридизации
Процесс амплификации использует протокол трехстуленчатого цикла с денатурацией,
праймерами и зондами отжига и шагом элонгации. Флуоресцентный сигнал контролируется во время
отжига.
9.2.2.3 Молекулярные маяки
В целом, процесс амплификации использует протокол трехступенчатого цикла с денатруацией,
6