ГОСТ Р 55576—2013
- отрицательный контрольный образец (К-) - вместо ДНК-лробы вносят в пробирку 10 мм3ТЕ-
буфера:
- положительный контрольный образец (К+) - вносят в пробирку 0,01 см3ПКО ГМ соя-Яи/ГМ кукуруза-
Flu.
Общий объем реакции - 25 мм3, объем ДНК-пробы - 10 мм3.
10.1.2 Проведение амплификации и детекции флюоресцентного сигнала
Программа амплификации:
- денатурация первичная 95 X - 15 мин; -
цитирование 95 °С - 10 с. 59 “С - 60 с.
Цикл повторяют 40 раз.
Флюоресценцию для определения ГМ сои измеряют при температуро 59 °С на запрограммиро
ванных на приборе каналах FAM/Green, JOE/YeHow. ROX/Orange. CyS/Red согласно инструкции no
эксплуатации.
Флюоресценцию для определения ГМ кукурузы измеряют при температуре 59 °С на запрограм
мированных на приборе каналах FAM/Green, JOE/YeHow. ROX/Orange прибора согласно инструкции по
эксплуатации.
10.2 Анализ результатов амплификации
10.2.1 Режим анализа результатов амплификации приведен в таблице 1.
Программа
JOE/Yellow
Т а б л и ц а 1
FAM/Green
|
1
Устранение выбросов
Порог
Корректировка уклона
Устранение выбросов
Порог
ROX/Orange
5
1
\
Устранение
Порог
ц
1
i
Суб/Red
<(
1
%
Порог
Эндогенный контроль соя
%
I
35S
ГМ соя
10
0.05
+
10%0.2
%
NOS
♦
10
0.05
%
\
$
FMV
+
10
0.05
Эндогенный контроль кукуру
за
NOS
-
%
ГМ кукуру-
35S
за
+
10
0.05
+
10%0.05
%
+
10
0.05
П р и м е ч а н и е -Н а всех каналах, за исключением
Cy5iRed.
следует исключить циклы до десятого.
Полученные в ходе испытания данные - кривые накопления флюоресцентного сигнала - ана
лизируют по нескольким каналам детекции с помощью программного обеспечения прибора.
10.2.2Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой
флюоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией на графике зависи
мости интенсивности флюоресценции от количества циклов, что соответствует значения порогового
цикла «Ct».
Учет результатов испытания следует начинать с результатов амплификации ДНК контрольных
образцов.
Для положительного контроля амплификации по каналам FAM/Green, JOEJYellow, ROX/Orange
и Cy5!Rcd для ГМ сои и по каналам FAM/Green, JOE/Yellow. ROX/Orange для ГМ кукурузы должны
присутствовать значения порогового цикла «СЫ.
Для отрицательного контрольного образца и отрицательного контроля амплификации значения
порогового цикла «СР> по всем каналам должны отсутствовать.
В образце обнаружена ДНК сои/кукурузы. если по каналу JOE/Yellow для него определено зна
чение порогового цикла «Cf» s 35. При получении значения «СР> г 35 для анализируемой пробы тре
буется повторное испытание данной пробы, начиная с первого этапа анализа (экстракция ДНК). При
повторном получении аналогичного результата образец считать не подлежащим анализу из-за низко го
содержания в нем ДНК сои/кукурузы.
6