ГОСТ Р 55576—2013
9 Экстракция ДНК
9.1 Экстракцию ДНК проводят по ГОСТ Р 52173 или по 9.2 с использованием комплекта реаген
тов для выделения ДНК по 5.2.
9.2 Буфер для лизирующего реагента и раствор для отмывки 1 (если они хранились при темпе
ратуре от 2 JC до 8 °С) прогревают при температуре 64 °С до полного растворения кристаллов.
Пробирки с анализируемыми пробами ставят в штатив и добавляют еще одну пробирку для от
рицательного контроля выделения (на каждые 10 проб не менее одного отрицательного контроля вы
деления). В пробирку отрицательного контроля выделения (ОК) вносят 100 мм3ОКО.
Наконечниками с аэрозольным барьером вносят в каждую пробирку по 400 мм1буфера для ли
зирующего реагента и по 17 мм3лизирующего реагента. Тщательно перемешивают содержимое про
бирок на встряхивателе.
Пробирки инкубируют в термостате при температуре 64 °С в течение1ч. периодически встря
хивая на встряхивателе (пять раз через каждые 10-12 мин).
Нерастворенные частицы анализируемой пробы осаждают центрифугированием при 1 2 - 1 4
тыс. об/мин в течение 5 мин.
Надосадочную жидкость в объеме 200 - 350 мм3очень аккуратно (так. чтобы не попали взве
шенные частицы и капли жира) отбирают отдельными наконечниками с аэрозольными барьерами и
переносят в новые пробирки.
Пробирки с надосадочной жидкостью прогревают в течение 5 мин в термостате при температу
ре 64 °С. перемешивают и центрифугируют в течение 5 с при 5 тыс. об/мин на микроцентрифуге для
сброса капель с крышки пробирки.
В каждую пробирку отдельным наконечником добавляют по 25 мм3сорбента, предварительно
ресуспендированного на встряхивателе. Перемешивают на встряхивателе и инкубируют при комнат
ной температуре в течение 10 - 15 мин, перемешивая через каждые 2 мин. Сорбент осаждают цен
трифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 с. Надосадочную жидкость удаляют, используя ва
куумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.
В пробирки добавляют по 300 мм3раствора для отмывки 1. Перемешивают на встряхивателе до
полного ресуспенэирования сорбента. Сорбент осаждают центрифугированием при 5 тыс. об/мин на
микроцентрифуге в течение 30 с. Удаляют надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыва
тель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.
Процедуру отмывки повторяют дважды, используя по 500 мм3раствора для отмывки 2. и цен
трифугируют в течение 30 с при 10 тыс. об/мин на микроцентрифуге, удаляют надосадочную жид
кость полностью.
Пробирки с отмытым сорбентом помещают в термостат при температуре 64 °С на 5 - 10 мин
для подсушивания сорбента. При этом крышки пробирок должны быть открыты.
В пробирки добавляют по 50 мм3 Г£-буфера для элюции ДНК и перемешивают на встряхива
теле. Помещают в термостат при температуре 64 °С на 5 - 8 мин и периодически (один раз в минуту)
встряхивают на встряхивателе.
Пробирки центрифугируют при 12-16 тыс. об/мин на микроцентрифуге в течение 1 мин.
Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. которую затем используют для постановки
ПЦР и проведения амплификации в соответствии с разделом 10.
10 Постановка ПЦР и проведение амплификации с гибридизационно-
флюоресцентной детекцией в режиме реального времени
(Real Time PCR)
10.1 Для выявления ГМ сои и ГМ кукурузы методом Real Time PCR используют «ПЦР-комплект»
по 5.2.
10.1.1 Постановка ПЦР
Размораживают необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-£/?Г(ГМ соя-скрин/ГМ кукуру
за-скрин). Перемешивают на встряхивателе и сбрасывают капли с помощью кратковременного цен
трифугирования в течение 1- 3 с.
Для проведения одной реакции в пробирку вносят 10 мм3ПЦР-смеси-1-Р/?7.5 мм3ПЦР-буфера-
Flu и 0.5 мм3полимеразы (TaqF). Смесь перемешивают на встряхивателе. осаждая кратковременным
центрифугированием, затем вносят по 15 мм3смеси в микропробирки вместимостью 0.2 см3.
Используя наконечник с аэрозольным барьером, в подготовленные пробирки добавляют по 10
мм3ДНК испытуемых образцов. Необходимо избегать попадания универсального сорбента в реакци
онную смесь.
Ставят контрольные реакции амплификации:
5