ГОСТ 31781—2012
8.3.3 Формируют лунки в парафиновой пленке с помощью штампа: штамп с лунками, обращен
ными вверх, кладут на стол; накрывают парафиновой пленкой защитным покрытием вверх (по направ
лению линий отверстий); в парафиновой пленке, двигаясь вдоль линии лунок, делают углубления при
помощи стеклянной палочки, а затем снимают защитный слой.
8.3.4 Растворы, полученные по 8.1.4 из анализируемого образца и референс-обраэца. а также ра
створ стандартного набора калибровочных белков с известной изоэлектрической точкой, выбранный в
зависимости от заложенного в программе диапазона pH. вносят микродозатором в лунку в количестве 1.5
мкл.
8.3.5 Аппликатор опускают на поверхность растворов исследуемого образца, референс-образца
и стандартного набора калибровочных белков, помещенных в лунки, сформированные в парафиновой
пленке с помощью штампа по 8.3.3. нарушая поверхность капель для заполнения капилляров.
8.3.6 Аппликатор, наполненный образцами по 8.3.5. помещают в систему со стороны катода и
проводят ИЭФ в автоматическом режиме на полиакриламидных гелях по программам в соответствии с
таблицами 1 и (или) 2.
Выбор программы зависит от цели анализа: для выбора оптимального диапазона pH при изме
рении иэоэлектрических точек используют широкий диапазон pH 3.0—9.0. для характеристики и ана
лиза белков с небольшими различиями в изоэлектрической точке используют более узкие диапазоны:
pH 5,0—9.0 и pH 4.0—6.5.
Программы проведения изоэлектрофокусирования в широком и узких диапазонах pH состоят из
трех этапов:
- префокусирование (происходит формирование градиента pH).
- этап нанесения исследуемых образцов (белки вносятся в гель);
- этап разделения (белки мигрируют к своим изоэлектрическим точкам).
Т аб лица 1 — Программа проведения анализа ИЭФ в полиакриламидном геле в широком диапазоне
pH 3.0—9.0
Условия
Наименование этапаНомер этапа
Напряжение. ВТок. мА
Мощность. Вт
Температура. ’ С
Префокусирование
1.1
2000
Нанесение образца
1.22002.5
3.5
15
Разделение
1.32000
Т аб лица 2 — Программа проведения анализа ИЭФ в полиакриламидном геле в узких диапазонах pH: 5.0—8.0
или 4.0—6.5
Условия
Наименование этапаНомер этапа
Напряжение в
Ток. мАМощность. Вт
Температура. ’С
Префокусирование
2.12000
Нанесение образца
2.2200
2.03.S
15
Разделение
2.32000
Этап фокусирования продолжается от 8 до 10 мин. Общее время ИЭФ составляет около 30 мин.
После окончания ИЭФ полиакриламидный гель помещают в камеру для окрашивания.
8.4 Проведение окрашивания
Полиакриламидные гели окрашивают в автоматическом режиме с применением красителя кумас-
си бриллиантового голубого в соответствии с таблицей 3 для образцов с высоким (от 20 до 50 нг/мкл)
содержанием белка или с применением азотнокислого серебра в соответствии с таблицей 4 для образ
цов с низким содержанием белка (от 1до 5 нг/мкл).
5