ГОСТ 31487—2012
Рабочая зона градуировочного графика лежит в пределах от 0,25 до 0,60 единиц оптической плот
ности (ед. ОП).
Для построения каждой точки градуировочного графика вычисляют среднеарифметическое значе
ние оптической плотности трех параллельных измерений.
Градуировочный график строят для каждой новой партии реактивов, а также при замене прибора.
4.4 Отбор и подготовка проб
4.4.1 Отбор проб
Отбор проб проводят по ГОСТ 20264.0.
Анализируемые образцы в форме порошка или микрокапсулированные можно использовать без
предварительной подготовки. Анализируемые образцы вформе гранул следует измельчать (например,
на зерновой мельнице или в фарфоровой ступке) и просеивать через сито с диаметром отверстий не
более 1мм.
4.4.2 Приготовление основного раствора анализируемого образца
В плоскодонную стеклянную колбу помещают навеску анализируемого образца массой от 0,1 до
Юг* с точностью до 0,2 мг и суспендируют в небольшом количестве бидистиллированной воды
(до 50 см3) на магнитной мешалке втечение 15 мин (порошок, микрогранулы, микрокапсулы) или 60
мин (корма, кормовые смеси). Суспензию количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100
см3и доводят объем бидистиллированной водой до метки. Полученную суспензию центрифугируют
при час тоте вращения 7000 мин-1 втечение 15 мин. Для анализа используют надосадочную
жидкость.
Раствор готовят вдень определения.
4.4.3 Приготовление рабочего раствора анализируемого образца
Рабочий раствор готовят из основного раствора по4.4.2 путем его разведения вбидистиллирован
ной воде (например, в 20 раз) таким образом, чтобы при определении активности оптические плотности
опытных и контрольного растворов находились в пределах рабочей зоны градуировочного графика.
4.5 Проведение анализа
4.5.1 Втри пробирки (две опытные иодну контрольную) вносят по 1,0 см3рабочего раствора ана
лизируемого образца по 4.4.3. Пробирки помещают в ультратермостат или водяную баню с температу
рой (37 ± 1) °С и выдерживают втечение 5 мин.
4.5.2 В две опытные пробирки добавляют по 1,0 см3раствора субстрата фитата натрия по 4.3.4,
предварительно выдержанного вультратермостате или водяной бане стемпературой (37 ± 1) °С в тече
ние 5 мин, и перемешивают. Пробирки помещают вультратермостат или водяную баню стемпературой
(37 ± 1) °С на 15 мин.
4.5.3 В контрольную пробирку вносят 1,0 см3раствора субстрата фитата натрия по 4.3.4. В конт
рольную и две опытные пробирки добавляют по 2,0 см3раствора натрия молибдата по 4.3.2 и 0,5 см3
рабочего раствора олова хлорида по 4.3.3 и тщательно перемешивают.
4.5.4 Пробирки (две опытные и одну контрольную) выдерживают одну минуту при комнатной тем
пературе. Растворы колориметрируют при длине волны от 650 до 700 нм вкювете с толщиной погло
щающего светслоя 3 мм, против контроля на реактивы. При необходимости (опалесценция, взвесь
и т. д.) раствор центрифугируют при 7000 мин-1.
5 Метод определения ферментативной активности фитазы
с образованием фосфорнованадиево-молибденового комплекса
5.1 Характеристика метода
5.1.1 Метод основан на определении содержания неорганических фосфатов (Р04), образующих
ся в результате действия фермента фитазы на субстрат — фитат натрия (натриевую соль фитиновой
кислоты) — при определенных стандартных условиях, путем их связывания ванадиево-молибденовым
реактивом с образованием фосфорнованадиево-молибденового комплекса желтого цвета.
5.1.2 За единицу фитазной активности (1 ед. ФА) принимают количество фермента, катализирую
щего гидролиз фитата натрия собразованием 1мкмоля неорганического фосфата за одну минуту встан
дартных условиях (температура — 37 °С, значение pH 5,5, продолжительность гидролиза — 15 мин).
5.1.3 Интенсивность окраски измеряют фотоколориметрическим методом придлине волны от400
до415 нм.
* В зависимости от предполагаемой активности.
5