ГОСТ Р 51423-99
спектрофотометр для проведения измерений при длине волны 750 нм:
хронометр для измерения времени с точностью до 1 с;
pH-метр для измерения pH с точностью до 0.1 единицы:
стеклянную палочку, один коней которой толще другого.
А.6 Проведение испытания
А.6.1 Приготовление раствора пепсина
Навеску пепсина массой 150 мг (или массу, необходимую для получения оптической плотности
0,35+0,035) растворяют в 100 см5разведенной соляной кислоты, с (HCI) = 0,06 моль/дм3.
2 см* приготовленного раствора переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 50 См3 и доводят
объем содержимого в колбе разведенной соляной кислотой, с (НС1) = 0,025 моль/дм5, до метки. Значение pH
приготовленного раствора должно быть 1,610,1.
Колбу с раствором погружают в водяную баню температурой 25 “С.
А.6.2 Гидролиз
В пробирку с помошью пипетки переносят 5.0 см5 раствора гемоглобина и нагревают на водяной бане
до 25 *С. В пробирку вносят 1,0 см3 раствора пепсина; содержимое пробирки перемешивают стеклянной
палочкой, совершая около 10 возвратно-поступательных движений. Пробирку выдерживают на водяной бане
при (25*1) ®С в течение 10 мин ± 1 с. отсчитывая время с момента внесения раствора пепсина. Необходимо
точнособлюдать продолжительность итемпературу инкубации. Поокончании инкубации в пробирку добавляют
10.0 см3 раствора трихлоруксусной кислоты, предварительно подогретого до (25±1) ‘С, содержимое пробирки
перемешивают и фильтруют через сухую фильтровальную бумагу.
А.6.3 Проведение цветной реакции и игмеренне оптической плотности
5.0 см5 фильтрата переносят пипеткой в коническую колбу вместимостью 50 см3. В колбу добавляют
10.0 см3 раствора гидроксида натрия и, при постоянном перемешивании. 3,0 см1 разбавленного реактива
Фалина—Сиокалто. Через 5 — 10 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре
при длине волны 750 нм в кювете рабочей длиной 1см. В качестве раствора сравнения используют воду.
А.6.4 Контрольное испытание
Контрольное испытание проводят при каждом определении.
5.0 см5раствора гемоглобина переносят пипеткой в пробирку, подогревают на водяной бане до (25±1) ‘С,
добавляют 10,0 см3раствора трихлоруксусной кислоты, предварительно подогретого до (25±1) ‘С. Содержимое
пробирки перемешиваю! и вносят 1.0 см5 раствори пепсина. Раствор в пробирке псрсх1ешнвнюг стеклянной
палочкой. Пробирку выдерживают па водяной бане при температуре (25±1) ‘С в течение 10 мин ±1 с, после
чего раствор фильтруют через сухую фильтровальную бумагу. Дальнейшее испытание выполняют по А.6.3.
А.6.5 Построение !ралунровочного графика
В шесть комических колб вместимостью 50 см’ помещают 0: 1,0; 2.0; 3,0; 4.0 и 5.0 см5 стандартного
раствора тирозина, что соответствует 0; 0,2; 0,4:0,6; 0,8 и 1.0 мкмольтирозина. Вколбы добавляют разведенную
соляную кислоту, с (HCI) = 0.2 моль/дм3, в таком количестве, чтобы объем содержимого в каждой колбе
составил 5,0 см3.
В каждую колбу вносят по 10,0 см3 раствора гидроксида натрия и. при постоянном перемешивании.
3.0 см3разбавленного реактива Фалина—Сиокалто. Измеряют оптическую плотность растворов в соответствии
с А.6.3.
Строят градуировочный трафик зависимости оптической плотности от массы тирозина в микромолях.
А.7 Обработка результатов
По градуировочному графику определяют массу тирозина в микромолях, соответствующую оптической
плотности окрашенного раствора, скорректированной с результатом контрольного испытания.
Активность пепсина а, мкмоль/г в минуту при (25±1) *С. рассчитывают по формуле
„ =
т/ ’
(А.1)
где п —масса тирозина, найденная по градуировочному графику, мкмоль;
т —масса пепсина, взятая в А.6.1, мг;
/ —продолжительность реакции, мин (т«= 10 мин).
П р и м е ч а н и е —Две единицы активности пепсина на миллиграмм, полученные настоящим методом,
соответствуют 3.64 мпллиедишшам Айсона на миллиграмм (в микромолях тирозина на миллиграмм в минуту
при 35,5‘С) или 36400 коммерческим единицам на грамм (в микромолях тирозина на грамм за 10 мин при 35.5
°С).
59
6