ГОСТ Р 51423-99
ПРИЛОЖЕНИЕ А
(обязательное)
Определение активности пепсина
А.I Область распространения
Настоящее приложение устанавливает метод определения активности пепсина, используемый при
определении массовой доли растворимого азота после обработки пепсином в разведенной соляной кислоте.
А.2 Определение
В настоящем приложении использован следующий термин с соответствующим определением:
единица активности пепсина: Масса пепсина, необходимая для высвобождения за одну минуту при
определенных условиях тою количества оксиарильных групп, которое при взаимодействии с реактивом
Филина—Сиокалто дает оптическую плотность, эквивалентную 1 мкмоль тирозина в тех же условиях.
А.З Сущность метода
Обработка гемоглобина пепсином в разведенной соляной кислоте. Осаждение нсгидролизованной части
белка трихлоруксуснон кислотой. Филы рання идобавление пироокиси натрия и реактива Фалина—Сиокалто.
Измерение оптической плотности этого раствора при длине волны 750 нм и определение соответствующей
массы тирозина с помощью градуировочного графика.
А.4 Реактивы
Используют реактивы квалификации х.ч. или ч.д.а., дистиллированную или деминерализованную воду:
соляную кислоту малярной концентрации с (НО) = 0.2 моль/дм1;
соляную кислоту малярной концентрации с (НО) = 0,06 моль/дм1;
соляную кислоту малярной концентрации с (НО) = 0.025 моль/дм";
раствор трихторуксусной кислоты массовой концентрации с (CCljCOjH) = 50 г/дх!5;
раствор гидроксида натрии молярной концентрации с (NaOH) = 0.5 моль/дм’:
реактив Фалина—Сиокалто
В круглодонную колбу со шлифом вместимостью 2 дм ’ помещают 100 г дигидрата вольфрамата натрии
(Nai WO4-2HiO), 25 г дигидрата молибдата натрия (Na2Mo04■2Н20> и 700см3воды. В колбу добавляют 50 см’
фосфорной кислоты. р(Н_,Р04) = 1,71 г/см5 и 100 ем" концентрированной соляной кислоты. р(НС1) = ■=
1.19 г/см5. К колбе присоединяют обратный холодильник, раствор доводят до кипения и аккуратно кипятят в
течение 10 ч. Затем колбу охлаждают, отсоединяют обратный холодильник, добавляют 175 т дипирата
сульфата
лития
(Li,S04• 2Н,0), 50 см5 воды it 1см-1брома. Содержимое колбы кипятят в течение 15 мин для
удаления избытка брома.
Колбу охлаждают, раствор декантируют в мерную колбу вместимостью 1дм1. Объем содержимого в колбе
доводят до метки дистиллированной водой, раствор перемешивают и фильтруют. Остаточная зеленоватая
окраска раствора нс допускается.
Перед использованием один объем реактива разводят двумя объемами волы:
раствор гемоглобина
Берут навеску гемоглобине-протеинового субстрата окало 2 г по методу Айсона, соответствующую 354 мг
азота, и помещают се в колбу со шлифом вместимостью 200 см! и отметкой на уровне 100 см1.
П р и м е ч а н и е —При необходимости определяют массовую долю азота в субстрате с помощью
микрометода Къельдаля. Ожидаемая массовая доля азота составляет 17,7 %.
В колбу с субстратом вносят небольшое количество разведенной соляной кислоты, с (HCI) =
= 0.06 моль/дм", подсоединяют колбу к вакуумному насосу и перемешивают содержимое до полного раство
рения гемоглобина. После этого спускают вакуум и. при постоянном перемешивании, добавляют в колбу
разведенную соляную кислоту той же молярной концентрации до отметки на уровне 100 см5.
Раствор готовят непосредственно перед использованием;
стандартный раствор тирозина малярной концентрации c(C4HMNO-) = 0.2 ммоль/дм".
Для приготовлении основного раствора в мерной колбе вместимостью 1дм1растворяют 181,2 мг тирозина
в разведенной соляной кислоте, с (HCI) =»0,06 моль/дм\ доводят сю объем содержимого в колбе до мелки.
20 см3 основного растворы переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем
содержимого в колбе до метки разведенной соляной кислотой, с (НС1) *»0.06 моль/дм3.
Молярная концентрации тирозина в приготовленном стандартном растворе составляет 0,2 мкмоль/см3
(0,2 ммоль/дм1).
А.5 Оборудование
Используют обычное лабораторное оборудование:
водяную баню для поддержания температуры (25±1) ’С:
558