9
- вводах стандартного раствора ретинола аналогичной концентрации. Время удерживания ретинола составляет около 5 мин. Выполняют ввод порций экстракта пробы и стандартного раствора по очереди.
- Гидролиз ретинил-ацетата для градуировки
Готовят раствор ретинил-ацетата (см. 5.6) в этиловом спирте (см. 5.3) так, чтобы 1 см3 раствора содержал приблизительно 15000 ME витамина А.
Примечание — 1 ME витамина А равноценна 0,344 мкг ретинил-ацетата.
Используя бюретку на 5 см3 с ценой деления 0,02 см3 (см. 6.19), переносят (2,5 + 0,02) см3 этого раствора в колбу вместимостью 250 см3. Добавляют 20 см3 этилового спирта, 1 см3 раствора гидроокиси калия (см. 5.2) и 5 см3 раствора аскорбата натрия (см. 5.10).
К колбе присоединяют обратимый холодильник, погружают ее в кипящую водяную баню и выдерживают в течение 60 мин. Охлаждают колбу до комнатной температуры под струей холодной воды и переносят содержимое в делительную воронку (см. 6.13).
Ополаскивают колбу порцией 50 см3 дистиллированной воды, затем порцией 25 см3 этилового спирта и добавляют смывы в делительную воронку. Экстрагируют витамин А из водно-спиртовой фазы одной порцией 80 см3 петролейного эфира, затем еще двумя порциями петролейного эфира по 50 см3.
Объединяют экстракты петролейного эфира, затем смывают двумя порциями дистиллированной воды по 50 см3. Добавляют (2 + 0,1) г безводного сернокислого натрия (см. 5.9).
Количественно переносят экстракт петролейного эфира в мерную колбу вместимостью 250 см3 и доводят объем петролейным эфиром до метки.
Концентрация ретинола в этом растворе (раствор 1) равна 150 ME/см3.
- Стандартизация раствора ретинола для градуировки
Пипеткой (см. 6.18) переносят (5 + 0,03) см3 раствора 1 (см. 9.5) в мерную колбу вместимостью 50 см3 и удаляют растворитель при температуре окружающей среды струей инертного газа (см. 5.11).
Растворяют остаток в 2-пропаноле и доводят объем 2-пропанолом до метки.
Измеряют поглощение (А) раствора, используя 2-пропанол в качестве контроля, при длине волны 310, 325 и 334 нм. Значения поглощения будут приблизительно 0,7—0,8. При необходимости допускается использовать промежуточное разведение.
Скорректированное поглощение при длине волны 325 нм, (А325 корр), вычисляют по формуле
А325, корр = 6,815 • А325 - 2,555 • А310 - 4,26 ' А334, (1)
если
Аэ25-корр <0,97, (2)
A
корр
то для стандартизации используют значение А325 корр; в противном случае используют А325. Концентрацию ретинола в растворе 1, с, ME/см3, вычисляют по формуле
с = А325 • 183 ME/см3 (3)
или
с = А325, орр' 183 ME/см3. (4)
- Приготовление стандартного образца ретинола для хроматографии
Готовят раствор ретинола в 2-пропаноле (см. 5.4) приблизительно такой же концентрации, как ожидается в экстракте (см. 9.4.1). На каждые 1000 ME витамина А на килограмм пробы в экстракте ожидается концентрация ретинола 2,5 ME/см3.
Выпаривают аликвотный объем раствора 1 (см. 9.5) досуха при окружающей температуре в потоке инертного газа (см. 5.11). Растворяют остаток в подходящем объеме 2-пропанола, чтобы обеспечить требуемую концентрацию ретинола, и перемешивают. При необходимости фильтруют стандартный раствор через мембранный фильтр (см. 6.6).
Допускается для градуировки использовать стандартный раствор витамина А (ретинола) в 2-пропаноле, приготовленный путем разбавления исходного стандартного раствора ретинола, полученного при растворении соответствующего количества стандартного образца ретинола (см. 5.6.2) непосредственно в 2-пропаноле.