8
В коническую колбу с анализируемой пробой добавляют 2 см3 раствора аскорбата натрия (см. 5.10), 50 см3 раствора гидроокиси калия (см. 5.2) и снова помешивают колбу круговыми движениями. Подсоединяют к колбе обратимый холодильник (см. 6.12) и погружают колбу в кипящую водяную баню (см. 6.3).
Колбу с содержимым и обратимым холодильником выдерживают на кипящей бане в течение 60 мин, время от времени помешивая круговыми движениями.
Колбу извлекают из бани и охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды как можно быстрее.
- Экстракция витамина А (ретинола)
- Содержимое колбы переносят в цилиндр для экстракции (см. 6.5.1), ополаскивают колбу для омыления двумя порциями по 25 см3 этилового спирта или технического метилированного спирта (см. 5.3) и переносят их в цилиндр.
Повторяют ополаскивание колбы двумя порциями по 125 см3 петролейного эфира (см. 5.5) и одной порцией 250 см3 дистиллированной воды (см. 5.1), каждый раз перенося ополаскивающие порции в цилиндр. Закрывают цилиндр пробкой и энергично встряхивают в течение 1 мин, время от времени сбрасывая давление.
Охлаждают цилиндр под струей холодной воды.
После разделения двух жидких фаз пробку вынимают, смывают боковые стороны пробки небольшим количеством петролейного эфира и вставляют в цилиндр насадку (см. 6.5.2) с регулируемой сифонной трубкой (см. 6.5.3), располагая нижний открытый конец трубки таким образом, чтобы он располагался прямо над уровнем границы разделения двух фаз.
Путем приложения через отводную трубку небольшого давления с помощью инертного газа (см. 5.11) переносят верхний слой петролейного эфира в делительную воронку вместимостью 1000 см3 (см. 6.13).
- В цилиндр для экстракции добавляют 125 см3 петролейного эфира, закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение 1 мин. Дают слоям разделиться и переносят верхний слой в ту же делительную воронку с помощью регулируемой трубки как описано в 9.3.1.
- Повторяют этап экстракции витамина А по 9.3.2.
- Объединенные экстракты петролейного эфира промывают четырьмя порциями по 100 см3 дистиллированной воды, сначала немного наклоняя делительную воронку из стороны в сторону, потом слегка встряхивая, чтобы свести к минимуму образование эмульсии.
- Промытый экстракт через воронку для фильтрования (см. 6.14), заправленную фильтровальной бумагой средней или быстрой фильтрации (см. 6.15) со слоем 60 г безводного сернокислого натрия (см. 5.9), переносят в круглодонную колбу (см. 6.16), подходящую для вакуумного выпаривания.
Делительную воронку споласкивают двумя порциями по 20 см3 петролейного эфира и добавляют их через фильтр в колбу для выпаривания.
Промывают фильтр еще двумя порциями по 25 см3 петролейного эфира и добавляют их в колбу для выпаривания.
- Петролейный эфир выпаривают из экстракта досуха на роторном испарителе (см. 6.4) под вакуумом при температуре не выше 40 °С. Атмосферное давление восстанавливают с помощью инертного газа (см. 5.11).
Примечание — Нумерация пунктов введена с целью использования ссылок на повторяющиеся этапы испытаний.
- Высокоэффективная жидкостная хроматография
- Остаток (см. 9.3.6) растворяют в минимальном объеме 2-пропанола (см. 5.4) и переносят количественно в мерную колбу вместимостью 20 см3 (см. 6.21).
Колбу для выпаривания ополаскивают тремя небольшими порциями 2-пропанола, перенося смывы в ту же мерную колбу. Доводят объем содержимого колбы до метки 2-пропанолом и перемешивают.
Для кормов, содержащих витамина А более 100000 ME/кг, рекомендуется дальнейшее разведение.
При необходимости экстракт пробы фильтруют через мембранный фильтр (см. 6.6).
- При невозможности проведения испытания в течение одного дня экстракт хранят в атмосфере инертного газа (см. 5.11) в холодильнике при температуре 4 °С, а затем выдерживают в темном месте до достижения комнатной температуры.
- Вводят 10 мм3 экстракта пробы в колонку жидкостного хроматографа (см. 6.1) и измеряют площадь пика ретинола.
Рассчитывают среднюю площадь пика по повторным вводам экстракта пробы и определяют концентрацию ретинола в экстракте со ссылкой на среднюю площадь пика, полученного при повторных