ГОСТ 18663-78 С. 6
2.0 см3. Затем объем содержимого каждой пробирки доводят до 10 см’ добавлением дистиллирован
ной воды.
3.5.2.6. Подготовка исследуемой пробы кормового витамина В13для анализа
Навеску препарата массой 1 г, взвешенную с погрешностью не более 0.0001 г, измельчают и
суспензируют в 50 см’ дистиллированной воды. Для стабилизации добавляют 0.05—0.10 г азотисто
кислого натрия или 1—2 см1 0,02 %-ного раствора цианистого калия и несколькими каплями 1 и.
соляной кислоты доводят pH суспензии до 5.0—5,5. Избыток кислоты нейтрализуют 0,5 и. раствором
едкого натра.
Затем суспензию кипятят в течение 20 мин на водяной бане или помещают в автоклав на
15 мин при давлении 0.5—1.0 кгс/см2, после чего охлаждают.
Охлажденную суспензию переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят pH до
6,8—7,0 добаачением 0,5 н. раствора едкого натра и 1н. раствора соляной кислоты идоливают колбу
дистиллированной водой до метки.
Смесь фильтруют через бумажный фильтр и часть профильтрованного экстракта разбавляют
водой до такой концентрации, чтобы в 1 см3 содержалось приблизительно 0.02—0,05 мг витами на
В,2.
3.5.2.5, 3.5.2.6. (Измененная редакция, Изм. Ле 1).
3.5.2.7. Приготовление контрольной пробы
В исследуемой пробе может содержаться метионин, к которому чувствителен штамм Е. сой
113—3, поэтому проводят контрольный анализ исследуемого экстракта, где витамин В,2 предвари
тельно разрушают. Для этого 5 см3 экстракта смешивают с 5 см3 0,2 н. едкого натра и
кипятят в течение 20 мин на водяной бане с обратным холодильником. После охлаждения
раствор нейтрали зуют добаатеннем 1 н. соляной кислоты и разбавляют водой до такой же
степени, как и в опыте с неразрушенным витамином В,,.
3.5.2.8. IIригоюолеине разведений исследуемого раствора кормового витамина В12
Из исследуемой пробы готовят три разведения (в двух повторностях каждое), для чего в 6
пробирок (по две ятя каждого разведения) вносят по 5 см’ основной среды и следующие количества
экстракта: 0,5; 1,0; 2,0 см3. Кроме того, готовят три разведения контрольного раствора. Для этого в
три пробирки вносят по 5 см3основной среды и следующие количества контрольного раствора: 3;
4; 5 см3. Затем объем содержимого каждой пробирки доводят до К) см3добавлением дистилли
рованной воды.
3.5.3. Ировескние испытания
Испытание состоит из составления калибровочной линии для чистого витамина В12 и непо
средственного испытания исследуемой пробы.
Пробирки с разведением стандартного и исследуемого растворов помешают в автоклав на
20 мин при давлении 1 кгс/см:, после чего охлаждают. Затем засевают каждую пробирку одной
каплей бактериальной суспензии (приготовленной по п. 3.5.2.4) и ставят в термостат на 20—24 ч при
температуре 37 *С.
По истечении указанного времени пробирки прогревают в автоклаве текучим паром 15 мин и
охлаждают. После охлаждения содержимое пробирок взбалтывают и измеряют мутность на фотоэ-
лектроколориметре или нефелометре. При использовании фотоэлекгроколори метра замеры делают
при синем светофильтре. Контрольным раствором для определения мутности является дистиллиро
ванная вола.
По полученным данным на миллиметровой бумаге строят калибровочный график. На оси
ординат откладывают значение мутности для каждого стандартного разведения (среднее из трех
пробирок), а на оси абсцисссоответствующее количество витамина В,2. При соединении полученных
точек получают калибровочную линию.
При незначительном разбросе точек калибровочную линию проводят между ними на рассто
янии. равноудаленном от большинства точек.
3.5.4. Обработка /кзультатов
Содержание витамина В13 определяют отдельно в каждой пробирке исследуемой пробы при
помощи калибровочной линии. Данные, которые не укладываются в калибровочную линию, от
брасывают. По данным, которые уложились в линию (не менее двух разведений), определяют
количество витамина В|: в исследуемой пробе, затем вычисляют среднее арифметическое результа
тов двух разведений.
Если наблюдается рост бактерий в контрольных пробирках, где витамин разрушен, то находят
97