С. 3 ГОСТ 29139-91
Гидролиз осуществляют на кипящей водяной бане в течение 40 мин. закрыв горло колбы во
ронкой диаметром 35 мм.
Содержимое колбы следует периодически перемешивать, особенно в первые 5 мин.
По окончании гидролиза колбу охлаждаютдо комнатной температуры и с помощью насыщен
ного водного раствора уксуснокислого натрия доводят pH гидролизата до 4,5iO. 1(потенциометрн-
чески).
После этого к гидролизату добавляют навеску амилоризина массой 0.10 г, 2—3 капли толуола и
затем колбу помещают в термостат на 14—16 ч при температуре 37 "С. После этого гидролизат
охлаждают, доводят его объем до 250 см3 дистиллированной водой и фильтруют. Вфильтрате опре
деляют содержание рибофлавина.
Если имеется необходимость прервать анализ на 1—2 дня, то перед доведением объема до
250 см3 гидролизат кипятят 5 мин, охлаждают, доводят объем до 250 см3и фильтруют.
Одновременно аналогичным образом готовят контрольный раствор на содержание рибофла
вина в амилоризине, используя то же количество ферментного препарата и реактивов, но без навес
ки исследуемой пробы.
До проведения анализа фильтрат хранят в холодильнике в плотно закрытой колбе.
4.3. О ч и с т к аг и д р о л и з а т аотп р и м е с е й ,м е ш а ю щ и х о п ре д е л е-
II и ю
К 100 см3фильтрата добавляют 2 см3раствора серной кислоты концентрации 0,3 г/с.м3и с по
мощью пипетки пли бюретки по каплям раствор марганцовокислого калия концентрации 0.03
г/с.м3. постоянно перемешивая до получения малинового окрашивания.
Избыток марганцовокислого калия удаляют добавлением по каплям раствора перекиси водо
рода до обесцвечивания фильтрата.
Количество израсходованных растворов серной кислоты, марганцовокислого калия и переки
си водорода (в кубических сантиметрах) приплюсовывают к первоначально взятому на окисление
объему фильтрата, чтобы определить конечный объем раствора.
Полученный раствор переносят в делительную воронку, добавляют 30—50 см3хлороформа и
встряхивают в течение I мин. После разделения слоев хлороформный слой (нижний) отбрасывают,
а водную фазу используют для дальнейшего определения.
4.4. Ф о т о л и з
Фотолиз проводят в пяти конических колбах с притертыми пробками.
В четыре колбы наливают по 20 см3очищенного гидролизата, в две из которых добавляют по
2 см3 рабочего стандартного раствора рибофлавина.
В пятую колбу налипают 20 см3 контрольного раствора.
Во все пять катб добавляют по 4 см3 раствора гидроокиси натрия концентрации 7 моль/дм3,
закрывают колбу пробками, перемешивают содержимое и облучают их светом двух светильников с
лампами накаливания по 100 Вт каждая с расстояния 30 см в течение 40 мин.
Температура окружающего воздуха должна быть не ботее 25 ’С. Для поддержания указанной
температуры воздуха используют настольный вентилятор.
Немедленно по окончании облучения растворы во всех колбах подкисляют 4 см3 ледяной
уксусной кислоты, добавляют к ним по 20 см3 хлороформа, закрывают притертыми пробками и
встряхивают в течение 2 мин. избегая образования эмульсии.
Затем все колбы оставляют на 10—15 мин для расслоения водной и хлороформной фаз.
После этого пипеткой отбирают по 10—12 см3хлороформного раствора (нижний слой), кото
рый фильтруют через бумажный фильтр с безводным сернокислым натрием в флюорометрические
пробирки.
Время с момента начала фильтрации раствора люмифлапина до измерения его флюоресцен
ции не должно превышать 30 мин.
4.5. И з м е р е н и е ф л ю о р е с ц е н ц и и х л о р о ф о р м н о г о р а с т в о р а
При работе на флюорометре марки ЭФ-ЗМА устанавливают светофильтры для витамина В2.
При работе на флюорометре марки ФМ-Ц-2 устанавливают светофильтры, дающие длины
волн возбуждения и флюоресценции 450 и 550 нм соответственно.
Измерение интенсивности флюоресценции растворов осуществляют по отношению к хлоро
форму.
При работе на флюорометрах других марок интенсивность флюоресценции люмифлапина из
меряют при светофильтрах, дающих длины волн возбуждения в области 350—480 нм, флюоресцен
ции —475—650 нм.