ГОСТ Р 56140—2014
мешивают вращением колбы и плавят в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Время
плавления агарозы в микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее загруженности одной колбой -1,5
мин.
10.1.3 Вынимают колбу с расплавленной агарозой из микроволновой печи, аккуратно переме
шивают. вращая колбу.
10.1.4 После этого вновь помещают колбу с агарозой в микроволновую печь на 1,5 мин (при
мощности 800 Вт), доводят агарозу до кипения.
10.1.5 Вынимают колбу из микроволновой печи и остужают агарозу до температуры 65 °С — 70
°С, вращая колбу.
10.1.6 К раствору агарозы, полученному по 10.1.5. добавляют 0.005 см3 раствора бромистого
этидия концентрацией 10 мг/см3, тщательно перемешивают раствор. Полученный агарозный гель ис
пользуют для заливки в рамку камеры.
10.1.7 Выравнивают столик для заливки гелей, заливают агарозный гель, полученный по 10.1.6,
в рамку камеры.
10.1.8 Устанавливают гребенки, не касаясь дна рамки камеры, на расстоянии не менее 3 см
друг от друга. Толщина агарозного геля должна быть около 0.6 см.
10.1.9 После полного застывания агарозного геля (30 мин при комнатной температуре), осто
рожно вынимают из него гребенки, не повредив лунки. Помещают рамку с готовым агарозным гелем в
камеру так, чтобы лунки располагались ближе к отрицательному электроду. Заливают в камеру рабо
чий электрофорезный буфер по 10.1.1 так. чтобы он покрыл агарозный гель на 5 мм сверху.
10.2 Проведение электрофореза
10.2.1 Из пробирок с продуктами амплификации по 9.7 отбирают по 10 - 15 мм3 исследуемых
проб и вносят в лунки агарозного геля (если для нанесения разных проб используют один и тот же
наконечник, то его промывают буфером по 10.1.1 после нанесения каждой пробы). В каждом ряду лу
нок агарозного геля должен быть обязательно представлен К+.
10.2.2 Подключают камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК должна двигаться в
направлении положительного электрода). Электрофорез проводят при напряжении от 100 до 150 В в
течение 20 - 30 мин, при этом краситель ксиленцианол. входящий в ПЦР-смесь-2, должен продви
нуться не менее чем на 1 см от старта. Оптимальная напряженность электрического поля при этом
составляет 10 В/см.
10.2.3 По завершении времени электрофореза выключают источник тока, переносят рамку с ге
лем на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх. Получают изображе
ние агарозного геля (электрофореграмму) на компьютере с помощью видеосистемы.
11 Учет результатов ПЦР
11.1 Учет результатов ПЦР проводят по наличию или отсутствию на электрофореграмме спе
цифической полосы амплифицированной ДНК.
Длина амплифицированного специфического фрагмента ДНК для праймеров, указанных в 6.4,
составляет 509 п. н.
11.2 Учет результатов ПЦР-анализа начинают с анализа результатов амплификации положи
тельных и отрицательных контрольных образцов. Режим анализа приведен в таблице 2.
Т а б л и ц а 2
Контроль
Этап ПЦР-анализа
Наличие специфической полосы 509
п. н. на электрофореграмме
4
_
«ПК»
«ОК»
«К-»
« к + »
Экстракция ДНК
Экстракция ДНК
ПЦР
ПЦР
4
П р и м е ч а н и е - Знак «+» обозначает наличие специфической полосы на электрофореграмме, знак «-»
- ее отсутствие.
11.3 В дорожках агарозного геля, соответствующих лункам, содержащим положительные кон-
троли (ПК и К+), должны быть яркие специфические светящиеся полосы на уровне 509 п. н.
11.4 В дорожках агарозного геля, соответствующих лункам, содержащим отрицательные контроли
(ОК и К—), не должно быть никаких полос, за исключением возможных праймер-димеров, находящихся
ниже уровня 100 п. н.
6