ГОСТ Р 56140—2014
- печь микроволновую, соответствующую требованиям ГОСТ IEC 60335-2-25 для плавления
агарозы;
- колбу коническую вместимостью 250 см3из термостойкого стекла по ГОСТ 21400;
- емкость пластиковую вместимостью 5 дм3 для дезактивации буфера и гелей, содержащих
бромид этидия;
- цилиндр мерный вместимостью 1 дм3 по ГОСТ 1770;
- ТБЕ-буфер для электрофореза (концентрированный буферный раствор, содержащий трис-
основамие молярной концентрации 0.089 моль/дм3, борную кислоту молярной концентрации 0.089
моль/дм3, ЭДТА молярной концентрации 0.002 моль/дм3. pH = 8.3);
- агарозу для электрофореза;
- раствор бромистого этидия 10 мг/см3, х. ч.;
- маркер молекулярных масс ДНК. содержащий фрагменты ДНК размером от 100 до 1000 л. н.
6.6 При приготовлении реагентов должны быть соблюдены требования ГОСТ 27025.
6.7 Допускается использование других средств измерений, оборудования, материалов, посуды
и реагентов с метрологическими и техническими характеристиками не ниже указанных выше.
7 Отбор, транспортирование и подготовка проб
7.1 При отборе проб, а также при их подготовке для исследования соблюдают меры, предупре
ждающие обсеменение объектов внешней среды.
7.2 Отбор проб проводят по ГОСТ 31929.
7.3 Отобранная лабораторная проба должна быть репрезентативной.
7.4 Транспортирование проб осуществляют при температуре, рекомендованной для хранения
производителем.
7.5 Сыворотки и жидкие вакцины используют для выделения ДНК без предварительной подго
товки. а пробы сухих вакцин готовят следующим образом; в ампулы (флаконы) с сухой вакциной вно сят
0,9 %-ный изотонический раствор хлорида натрия или дистиллированную воду по ГОСТ 6709 в
объеме, соответствующем объему вакцины до высушивания. После этого ампулы (флаконы) осто
рожно взбалтывают и отбирают 1см3пробы в одноразовую микропробирку вместимостью 1.5 см3.
8 Экстракция ДНК
8.1 Лизирующий раствор и раствор для отмывки 1. содержащие кристаллы, прогревают до их
полного растворения.
8.2 Готовят необходимое количество одноразовых пробирок (по числу исследуемых проб) и до
бавляют еще одну пробирку для отрицательного контроля экстракции и одну пробирку для положи
тельного контроля экстракции. Вносят в каждую пробирку по 300 мм3лизирующего раствора. Пробир ки
маркируют.
8.3 В пробирки с лизирующим раствором вносят по 100 мм3 исследуемой пробы, используя
наконечники с аэрозольным барьером.
8.4 В пробирку отрицательного контроля экстракции ОК вносят 100 мм3 ОКО. В пробирку положи
тельного контроля экстракции ПК вносят 90 мм3ОКО и 10 мм3ПКО. Если пробы готовили с использо
ванием 0.9 %-ного раствора натрия хлорида, то готовят еще один отрицательный контроль: в пробир ку
с лизирующим раствором вносят 50 мм3 0.9 %-ного раствора натрия хлорида и 50 мм3ОКО.
8.5 Содержимое пробирок тщательно перемешивают на встряхивателе и прогревают в течение
5 мин при температуре 65 °С. После этого пробирки центрифугируют в течение 5 с при 5000 об/мин
на микроцентрифуге.
8.6 В каждую пробирку отдельным наконечником добавляют по 25 мм3ресуспензированного на
встряхивателе универсального сорбента. Содержимое пробирок тщательно перемешивают на встря
хивателе. ставят в штатив на 2 мин. еще раз перемешивают и оставляют в штативе на 5 мин.
8.7 Осаждают универсальный сорбент в пробирках центрифугированием при 5000 об/мин в те
чение 30 с. Удаляют надсадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой ловушкой и
отдельный наконечник для каждой пробы.
8.8 Добавляют в пробирки по 300 мм3раствора для отмывки 1. Перемешивают на встряхивате
ле до полного ресуспензирования универсального сорбента. Сорбент осаждают центрифугированием
при 5000 об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с. Удаляют надосадочную жидкость в соответ
ствии с 8.7.
8.9 Добавляют в пробирки по 500 мм3раствора для отмывки 2. перемешивают до полного ре
суспензирования сорбента, центрифугируют в течение 30 с при 10000 об/мин на микроцентрифуге.
Удаляют надосадочную жидкость по 8.7.
8.10 Повторяют процедуру отмывки раствором для отмывки 2 по 8.9.
4