ГОСТ Р 56140—2014
8.11 Для подсушивания универсального сорбента пробирки после отмывки по 8.10 помещают в
термостат при температуре 65 °С на 5 — 10 мин. При этом крышки пробирок оставляют открытыми.
8.12 В пробирки добавляют по 50 мм3ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешивают на встряхи-
вателе. Помещают в термостат при температуре 65 °С на 5 мин. периодически встряхивая.
8.13 Центрифугируют пробирки на максимальных оборотах микроцентрифуги в течение 1 мин.
Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.
8.14 При использовании других готовых наборов реагентов выделение ДНК проводят согласно
инструкции по их применению.
9 Постановка ПЦР
9.1 В микропробирки вместимостью 0.5 см3для ПЦР вносят по 5 мм3ПЦР-смеси-1, наслаивают
сверху по 10 мм3расплавленного воска для ПЦР так. чтобы он полностью накрыл жидкость, закрыва ют
крышки. Если воск для ПЦР покрыл жидкость неровно или образовались пузыри, прогревают про бирки в
амплификаторе в течение 2 мин при температуре 95 °С и охлаждают.
Срок хранения готовой ПЦР-смеси-1 под воском при температуре минус 20 °С - не более 6 мес.
9.2 На поверхность воска вносят по 10 мм3 ПЦР-смеси-2. при этом она не должна проваливать
ся под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1.
9.3 Сверхудобавляют по капле вазелинового масла (примерно 25 мм3).
При использовании амплификатора с термостатируемой крышкой вазелиновое масло не до
бавляют.
9.4 Под масло или непосредственно на него вносят по 10 мм3надосадочной жидкости по 8.13,
используя наконечники с аэрозольными барьерами.
Ставят контрольные реакции амплификации:
- отрицательный контроль (К-). В пробирку вместо надосадочной жидкости по 8.13 вносят 10
мм3ТЕ-буфера;
- положительный контроль (К+). В пробирку вместо надосадочной жидкости по 8.13 вносят 10
мм3ПКО.
9.5 Перед постановкой пробирок в амплификатор осаждают капли с их стенок кратким центри
фугированием в течение 1— 3 с.
9.6 Пробирки с надосадочной жидкостью, отрицательным и положительным контролями после
центрифугирования ставят в амплификатор и запускают соответствующую программу.
При использовании ПЦР-смеси-1 с нуклеотидной последовательностью праймеров F1 и R1 по
6.4 запускают на амплификаторе программу, представленную в таблице 1.
Т а б л и ц а 1
Цикл
0
1
2
Температура
95’С
95’С
95 *С
61 ’С
72 ’С
Время |Циклы
Пауза
2 мин1
Юс
Юс
Юс
41
3
72 *С
1 мин1
44 ’СХранение в амплификаторе
9.7 После окончания программы собирают пробирки в штатив и отправляют для детекции про
дуктов ПЦР.
9.8 Срок хранения проб после амплификации при комнатной температуре - не более 16 ч. при
температуре от 2 °С до 8 °С - не более одной недели, при температуре не более минус 16 °С - не
ограничен.
10Детекция продуктов ПЦР-амплификации методом электрофореза в ага
розном геле
10.1 Приготовление рабочих растворов и агарозного геля
10.1.1 Готовят рабочий электрофорезный буфер: в мерный цилиндр вливают 25 см3 ТБЕ-
буфера. доводят дистиллированной водой до 500 см3 и перемешивают.
10.1.2 1.7 г агарозы для электрофореза ДНК помещают в стеклянную колбу из термостойкого
стекла вместимостью 250 см3. Наливают 100 см3рабочего электрофорезного буфера по 10.1.1. пере-
5