ГОСТ 32376—2013
3 Принцип метода
Суспензию бактериальных клеток экспонируют с исследуемым веществом в присутствии или
отсутствии экзогенной системы метаболической активации. В методе введения вещества на чашку
(plate incorporation method) эта суспензия смешивается с верхним агаром и выливается сразу на
чашку с минимальной средой. В преинкубационном тесте, смесь предварительно инкубируют, затем
смешивают с верхним агаром и выливают на слой минимальной среды. При исследовании обоими
методами после инкубации два - три дня подсчитывают колонии ревертантов и сравнивают с числом
колоний ревертантов на чашке в контроле с растворителем.
Были описаны несколько методик оценки частоты обратных мутаций у бактерий. Среди них
наиболее часто используются метод введения вещества на чашку, преинкубационный тест,
флуктуационный тест, и суспензионный метод.
Данный документ, преимущественно касается метода введения вещества на чашку и
преинкубационного теста. Оба подходят для проведения экспериментов с метаболическими
активациями и без них. Ряд веществ более эффективно исследовать в преинкубационном тесте. Эти
вещества относятся к химическим классам, которые включают короткие цепи алифатических
нитрозаминов,бивалентныеметаллы,альдегиды.азокрасителиидиазосоединения,
пиролизидиновые алкалоиды, аллилсодержащие соединения и нитросоединения. Также показано,
что некоторые классы мутагенов не всегда выявляются, при использовании стандартных процедур,
таких как метод введения вещества на чашку и преинкубационный тест. Они должны быть
рассмотрены как «особые случаи» и строго рекомендуется использование альтернативных методов
для их определения. К таким «особым случаям» могут быть отнесены (вместе с перечнем методов,
которые могут использоваться для их определения): азокрасители и диазосоединения, газообразные и
летучие химические вещества и гликозиды. Отклонение от стандартной процедуры должно быть
научно обосновано.
4 Описание метода
4.1 Материалы
4.1.1 Бактерии
Свежие культуры бактерий должны быть выращены до состояния поздней экспоненциальной
или ранней стабильной фазы роста (приблизительно 109 клеток на 1 мл). Культуры в поздней
стабильной фазе не используются. Необходимо, чтобы культуры, применяемые в эксперименте,
содержали высокий титр жизнеспособных бактерий. Титр может быть установлен либо из ранее
полученных данных кривой роста, либо в каждом опыте путем определения числа жизнеспособных
клеток в экспериментальном посеве.
Рекомендуемая инкубационная температура 37 С.
Необходимо использовать минимум пять штаммов бактерий. Они должны включать четыре
штамма Salmonella typhimurium (ТА1535; ТА1537 или ТА97; ТА98: ТА100), для которых показано, что
они дают надежный и воспроизводимый ответ в разных лабораториях. Эти четыре штамма Salmonella
typhimurium имеют GC пары оснований в первичном сайте реверсии. Это значит, что они не могут
выявлять ряд окисляющих мутагенов, соединения, вызывающие перекрестные сшивки, и гидразины.
Такие вещества могут быть обнаружены в опытах на Escherichia coli WP2 или Salmonella typhimurium
ТА102. у которых есть АТ пара оснований в первичном сайте реверсии.
Таким образом, рекомендуемая комбинация штаммов включает:
-Salmonella typhimurium ТА1535:
-Salmonella typhimurium TA1537 или TA97, или ТА97а;
-Salmonella typhimurium ТА98;
-Salmonella typhimurium TA100;
-Eschenchia coli WP2 uvrA или Escherichia coli WP2 uvrA(pKM101). или Salmonella typhimurium TA102.
Для определения мутагенов, вызывающих перекрестные сшивки, можно использовать штамм
Salmonella typhimurium ТА102 или профицитные по репарации штаммы Escherichia coli (например,
Escherichia coli WP2 или Escherichia coli WP2 (pKM101)).
Необходимы стандартные процедуры для ведения, хранения и проверки генотипов исходных
штаммов. Потребность аминокислоты для роста следует проверять для каждой замороженной
исходной культуры (гиститин для Salmonella typhimurium и триптофан для Escherichia coli). Также
должны быть проверены другие фенотипические характеристики: присутствие или отсутствие
плазмид R-фактора для соответствующих штаммов (резистентность к ампицилину у штаммов ТА98,
ТА100 и ТА97а или ТА97, WP2 uvrA и WP2 uvrA (рКМ101) и резистентность к ампицилину +
тетрациклину у штамма ТА 102): присутствие специфических мутаций (rfa мутаций у штаммов
2