ГОСТ 32634-2014
4 Описание метода
4.1 Модели кожи человека
Модели человеческой кожи могут быть сконструированы или приобретены на коммерческой
основе (например, модели EpiDerm™ и EPISKIN™) (17, 18. 19. 20] или разработаны и построены в
испытательной лаборатории [21. 22]. Считается, что использование кожи человека зависит от
национальных и международных этических стандартов и условий.
Л
юбая новая модель должна быть
проверена (по крайней мере, в степени, описанной в разделе 4.2). Модели кожи человека,
используемые для данного испытания, должны соответствовать следующим параметрам:
4.2 Общие параметры модели
Для построения эпителия должны быть использованы кератиноциты человека. Под
функциональным роговым слоем должны быть расположены несколько слоев жизнеспособных
эпителиальных клеток. Модель кожи также может иметь стромальный слой. Роговой слой должен
состоять из нескольких слоев с необходимым липидным профилем для создания функционального
барьера, достаточно устойчивого для проникновения цитотоксических маркеров. Сдерживающие
свойства модели должны препятствовать прохождению исследуемого материала через роговой слой в
жизнеспособные ткани. Прохождение исследуемого вещества через роговой слой приведет к
получению недостоверной имитации воздействия на кожу. Модель не должна быть загрязнена
бактериями (в том числе, микоплазмой) или грибками.
4.3 Функциональные параметры модели
Величина жизнеспособности, как правило, определяется количественно с использованием МТТ
или других витальных красителей, реагирующих на метаболические превращения. В таких случаях
оптическая плотность (ОП) экстрагированного (растворенного) красителя из ткани в негативном
контрольном эксперименте должна не менее чем в 20 раз превышать оптическую плотность самого
экстрагента (растворителя) (для дополнительной информации . [23]). Ткани для негативного
контрольного эксперимента должны быть стабильными в культуре (для обеспечения подобия оценки
жизнеспособности клеток) в течение всего периода воздействия. Роговой слой должен быть
достаточно надежным, чтобы противостоять быстрому проникновению некоторых цитотоксических
химических маркеров (например. 1% Тритон Х-100). Данное свойство может быть оценено по времени
воздействия, необходимому для снижения жизнеспособности клеток на 50% (ЕТ50) (например, для
моделей EpiDerm™ и EPISKIN™ данное время составляет > 2 часа). Модель должна
демонстрировать воспроизводимость в течение долгого времени и. желательно, при проведении
испытаний в разных лабораториях. Кроме того, используемая модель должна давать возможность
прогнозирования коррозионного потенциала стандартных химических веществ (таблица 1) при
использовании выбранного протокола испытаний.
4.4 Нанесение исследуемого и контрольного вещества
Для каждого испытания (времени экспозиции), в том числе контрольного, используют два
образца ткани. При исследовании жидких веществ достаточное количество исследуемого вещества
наносят равномерно на образец для полного покрытия поверхности кожи; необходимо использовать не
менее 25 мкп/см2. При исследовании твердых веществ, достаточное количество исследуемого
вещества равномерно наносят на образец для покрытия поверхности кожи. При этом исследуемое
вещество должно быть смочено деионизированной или дистиллированной водой для обеспечения
хорошего контакта с кожей. В случае необходимости, перед нанесением твердые вещества можно
измельчить. Нанесение вещества должно осуществляться приемлемым методом (см. (6]). По
окончании периода воздействия исследуемое вещество должно быть тщательно смыто с поверхности
кожи соответствующим буферным раствором или 0.9% раствором NaCI.
Для подтверждения надлежащего действия экспериментальных моделей в каждом испытании
должны использоваться параллельные положительные и отрицательные контрольные образцы. Для
положительного контрольного испытания рекомендуется использовать ледяную уксусную кислоту или 8
н. КОН. для отрицательного - 0.9% раствор NaCI или воду.
4.5 Измерения жизнеспособности клеток
Для оценки жизнеспособности клеток могут использоваться только подтвержденные
количественные методы. Кроме того, метод оценки жизнеспособности должен быть совместим с
использованием трехмерной модели. Неспецифическое связывание белка красителем не должно
мешать измерению жизнеспособности клеток. Таким образом, красители, связывающие белок или не
подвергающиеся метаболическим преобразованиям (например, нейтральный красный), не подходят
для использования в испытании. Наиболее часто используются краситель МТТ [3 - (4.5-
диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид, тиазолил синий, номер CAS 298-93-1)], для
которого были получены точные и воспроизводимыерезультаты [6]. Другие красители также могут
использоваться. Образец кожи помещают в раствор МТТ соответствующей концентрации (например.
2