6
- Приготовление буферного раствора активной кислотностью pH 7,0
6,055 г сухого трис(гидроксиметил)аминометана и 0,147 г кальция хлористого растворяют в 500 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 см3. После растворения реактивов рН раствора доводят до значения 7,0 при помощи добавления раствора соляной кислоты молярной концентрацией c(HCl) = 1,0 моль/дм3 по 6.3. После корректировки рН доводят объем буферного раствора в мерной колбе дистиллированной водой до метки.
Срок хранения раствора — не более 1 мес.
- Приготовление раствора пектатлиазы
0,5 г препарата пектатлиазы растворяют в стакане вместимостью 100 см3 в 50 см3 буферного раствора по 6.4. Раствор пектатлиазы готовят непосредственно перед проведением испытания.
- Проведение анализа
- Проведение деэтерификации пробы в щелочной среде
0,05 г анализируемой пробы вносят в мерную колбу вместимостью 100 см3. Поверхность пробы равномерно увлажняют 2-пропанолом. В колбу добавляют 50 см3 дистиллированной воды. Тщательно перемешивают содержимое энергичным встряхиванием. С помощью раствора гидроокиси натрия молярной концентрации c(NaOH) = 0,5 моль/дм3 по 6.1 доводят рН раствора в колбе до значения 12,0. Тщательно перемешивают содержимое колбы и оставляют для завершения реакции деэтерификации на 15 мин при комнатной температуре. Затем объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой.
- Для проведения анализа в три кюветы из кварцевого стекла дозируют реактивы в соответствии со схемой, приведенной в таблице 1.
Наименование | Раствор | Объем | Дистиллированная | Раствор |
кюветы | буферный | пробы | вода | пектатлиазы |
«Контрольфермент» | 0,5 | 1,0 | 1,0 | — |
«КОНТрОЛЬпроба» | 0,5 | — | 1,5 | 0,5 |
«Проба» | 0,5 | 1,0 | 0,5 | 0,5 |
Общий объем инкубационной смеси в каждой кювете составляет 2,5 см3. После добавления в кюветы всех реактивов содержимое перемешивают стеклянными палочками и измеряют в каждой кювете при 235 нм на спектрофотометре (фотометре) начальное значение оптической плотности смеси А0. Оставляют кюветы на 10 мин при комнатной температуре.
Проводят измерение при 235 нм на спектрофотометре (фотометре) конечного значения оптической плотности А10 смеси в каждой кювете.
- Обработка результатов измерений
8.1 Расчет общего начального значения оптической плотности, А0общ, рассчитывают по формуле
где А0 пр — начальное значение оптической плотности смеси в кювете «Проба»;
А0к ф — начальное значение оптической плотности смеси в кювете «Контрольфермент»;
А0к п — начальное значение оптической плотности смеси в кювете «Контрольпроба».
- Расчет общего конечного значения оптической плотности, А10общ, рассчитывают по формуле
А10 общ А10 пр (А10 к. ф + А10 к. п),
где А10 пр — конечное значение оптической плотности смеси в кювете «Проба»;
А10 к ф — конечное значение оптической плотности смеси в кювете «Контрольфермент»; А10к п — конечное значение оптической плотности смеси в кювете «Контрольпроба».