ГОСТ Р 56964—2016
Приложение А
(обязательное)
Провокационный метод в статических условиях
А.1 Порядок проведения испытания
А.1.1 Посев
Каждый из шести испытуемых образцов и шести контрольных образцов помещают в отдельную стерилизо
ванную широкогорлую емкость (5.7). Пипеткой добавляют (1.0 t 0,1) см3 посевного материала, приготовленного
согласно разделу 8 к каждому образцу для испытания, и плотно закрывают завинчивающейся крышкой. Число
необходимых для использования образцов зависит от его типа.
Если контрольных образцов нет. «засевают» широкогорлые емкости без образца для контроля эффектив
ности испытания, которые называют «контроль».
А.1.2 Извлечение после посева (нулевой момент времени)
Добавляют 20 см3 среды (6.4) в каждую из трех «засеянных» емкостей с испытуемыми и контрольными
образцами (если имеются). Завинчивают крышки и встряхивают емкости по дуге приблизительно 30 см в течение
примерно 30 с. или перемешивают в течение 5 циклов по 5 с на вихревом смесителе (5.9). чтобы бактерии попали в
питательную среду.
А.1.3 Инкубирование
Инкубируют «засеянные» испытуемые и контрольные образцы (если имеются) при температуре (37 ± 2) *С
в течение (24 i 1 )ч.
А.1.4 Извлечение после инкубации (время 24 ч)
Поступают no А.1.2.
А.1.5 Определение числа жизнеспособных бактерий. Поверхностная культура
Берут 1 см3 среды с извлеченными в нее бактериями из А .1.2 или из А .1.4 стерильной пипеткой и переносят
материал в пробирку, содержащую (9.0 ± 0.1) см3 физиологического раствора (6.5). хорошо встряхивают. Разбав
ляют полученную среду физиологическим раствором (6.5) и получают серию десятикратных разведений.
Высевают 100 мкп каждого разведения на питательный агар (NA) (6.3) по два раза, переворачивают чашки
с агаровой средой вверх дном и инкубируют от 24 до 48 ч.
После инкубации считают число колоний в чашках Петри, вмещающих от 30 до 300 колоний. Если минималь
ное число колоний менее 30. тогда подсчитывают и записывают число колоний на этих чашках. Если колонии
на чашках отсутствуют, записывают число колоний как < 1.
А.2 Обработка результатов
А.2.1 Расчет числа жизнеспособных бактерий
Для каждого испытуемого образца определяют число извлеченных жизнеспособных бактерий по формуле:
М = 2 В -20.(А.1)
где М — число жизнеспособных бактерий на каждом испытуемом образце;
2 — среднее число жизнеспособных бактерий в двух чашках Петри;
в — коэффициент разбавления;
20 — объем извлечения, см3.
А.2.2 Оценка эффективности теста
Предельное значение разности трех контролей после посева и инкубации должно быть A(lgC)£ 1. Среднее
число колоний контролей непосредственно после посева должно быть не менее 1■Ю5 КОЕ. В методе подсчета на
чашках вычисляют значение бактериального роста F по следующей формуле, причем F должно быть £ 0.
Я * IgC .-lgC *.(А.2)
где F — значение бактериального роста контролей;
Сг— среднее число колоний трех контрольных образцов после инкубации. КОЕУсм3.
Са — среднее число колоний трех контролей непосредственно после посева. КОЕ/см3.
Если указанные выше условия удовлетворены, то результат считают достоверным. Если не все условия
выполнены, то результат недостоверен и образцы необходимо испытать заново.
А.2.3 Расчет коэффициента антибактериальной активности
Вычисляют коэффициент антибактериальной активности согласно разделу 11.
6