ГОСТ Р 56058—2014
б) специфичные гену зеина (adhl6):
1) праймер 1: 5’ -CCA GCC ТСА TGG CCA AAG-3’;
2) праймер 2: 5-ССТ ТСТ TGG CGG СТТ АТС TG-3’;
3) зонд: 5-R6G-CTT AGG GGC AGA СТС CCG TGT ТСС CT-BHQ1-3’.
6 Сущность метода
6.1 Сущность метода идентификации и количественного определения содержания ГМ сои и ГМ
кукурузы методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
(Real Time PCR) заключается в проведении двух независимых ПЦР в одной пробирке с использова
нием специфичных праймеров и зондов, меченных флуоресцентными красителями, с целью выявле
ния участка эндогенной ДНК. характерной для всех линий ГМ сои или ГМ кукурузы, и участка реком
бинантной ДНК. специфичной для определенных генетических линий.
6.2 Возможно проведение ПЦР в двух пробирках с использованием одного красителя по ГОСТ
Р 53244.
7 Отбор проб
Отбор лабораторных проб, подготовка анализируемой пробы, условия хранения и транспорти
рования - по ГОСТ Р 55576.
8 Экстракция ДНК
ЭкстракциюДНК проводятв соответствиис ГОСТ Р 52173 или ГОСТ Р 55576.
9 Постановка ПЦР и проведение амплификации с гибридизационно-
флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR)
9.1 Приготовление реакционной ПЦР-смеси
Для приготовления реакционной ПЦР-смеси для определения ГМ сои или ГМ кукурузы берут 1
мм’деионизованной воды, по 1 мм3каждого праймера 1 по 5.3.2 концентрацией 5 * 10° моль/дм\ по 1
мм3 каждого праймера 2 по 5.3.2 концентрацией 5 * 10* моль/дм3, по 1 мм3 каждого зонда по 5.3.2
концентрацией 3 * 10* моль/дм3, 3 мм3 раствора дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) и смешива ют
в пробирке вместимостью 1.5 см3.
Срок хранения готовой ПЦР-смеси при температуре не выше минус 18 X - не более 12 мес.
9.2 Постановка ПЦР
9.2.1 ДНК. экстрагированную из анализируемой пробы (включая стандартные образцы), испы
тывают не менее, чем в двух повторностях.
9.2.2 .Цля проведения двух независимых ПЦР в одной пробирке смешивают 10 мм3ПЦР-смеси
по 9.1, 5 мм ПЦР-буфера и 0.5 мм3полимеразы (TaqF). Смесь перемешивают и осаждают на мик-
роцентрифуге-встряхивателе в течение 15-30 с.
9.2.3 В микропробирку вместимостью 0.2 см3 вносят по 15 мм3смеси, полученной по 9.2.2, за
тем. используя наконечник с аэрозольным барьером, добавляют в нее 10 мм3ДНК. полученной экс
тракцией из анализируемой пробы (ДНК-лроба) в соответствии с разделом 8. Общий объем реакции -
25 мм3.
9.2.4 Ставят контрольные реакции амплификации:
- отрицательный контрольный образец (К-) - вместо ДНК-пробы вносят в микропробирку со
смесью по 9.2.2 10 мм3ТЕ-буфера:
- положительный контрольный образец (К+) - вместо ДНК-пробы вносят в микропробирку со
смесью по 9.2.2 10 мм3 1 %-ного стандартного образца состава ГМ сои и ГМ кукурузы.
9.2.5 При каждой постановке ПЦР ставят шесть реакций амплификации со стандартными об
разцами ГМ сои и ГМ кукурузы для построения калибровочной кривой. Для этого в три микролробирки со
смесью по 9.2.2 вносят по 10 мм3 каждого стандартного образца, содержащего от 0,1 % до 5,0 % линий
ГМ сои и ГМ кукурузы. Реакцию амплификации проводят в двух повторностях.
П р и м е ч а н и е - Стандартный образец может иметь любую концентрацию в пределах указанного диа
пазона.
9.3 Проведение амплификации и детекции флуоресцентного сигнала
Программируют прибор для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
Программа амплификации для количественного определения ГМ сои приведена в таблице 1.
4