ГОСТ 31475—2012
После полимеризации водусливают исверхучерез пластиковый иаконечникот пипеточиогодоза
тора заливают формирующий гель. Гельзаливают в кассету на поверхность ранее полученного гелядо
верхних краев стеклянных пластинок, вставляют в раствор специальную пластмассовую гребенку для
формирования в геле углублений, в которые будут вноситься анализируемые образцы, и проводят
повторно полимеризацию в течение 20—30 мин. Для достижения лучшего разделения белковых полос
кассетус гелем можно выдержать в течение 10 чпри4 *С. Послеэтого гребенкуследуетудалить.
8.1.3 Всоответствиис инструкциейпоэксплуатации кассетузакрепляютв электрофорезмой каме
ре. тудаже помещаютэлектроды, спиральдля охлаждениябуфера изаливаютвэлектродную камерудо
краевэлектродный буфертак. чтобы буферный раствор покрывал верхний край кассеты с гелем.
После этого в каждое углубление микрошприцем вносят предварительно подготовленные по 7.2
растворы белковыхпроб в количестве 1—2 мкл, содержащихбелок из расчета 10—20 мкг наодноуглуб
ление. Допускается максимально вносить водноуглубление20 мкл растворабелка. Введениепробосу
ществляют медленно, так. чтобы вводимый раствор белка не всплывал содна углублений.
В отдельноеуглублениерядомсанализируемойпробойвносят5мкл растворамаркерныхбелковс
массовой концентрацией белка 1мкг/мкл, приготовленногопо 7.1.8.
Включаютэлектрическийтокипроводятпроцесспри плотности постоянноготока2,5 мАУсм2втече
ние 1—2 ч.
Время процесса зависитот состояниягеля(насколькосвежимибыли использованныерастворы), а
также от расстояния, на которое необходимо продвинуть белки.
8.1.4 В ходе электрофореза окрашенные в фиолетовый цвет полосы белков собираются на дне
углублений верхнегогеля, затемпродвигаются вниз. Происходитформированиемолекулбелка подвоз
действием тока (движение) и распрямление белковых глобул в присутствии СДС — реактива, способ
ствующего разворачиванию молекул белка (добавление 1,5 г СДС на 1 г белка вызывает его полную
денатурацию).
При закислении раствора окраска полос может измениться на желтую из-за наличия красителя
бромфенолового синего.
После прохождениябелковчерез верхнийгельполосысобираютсяна границедвухгелей, входятв
нижний сепарирующий гель, и происходит разделение белка на его составные части (фракции).
Путь, который проходит каждая полоса R,. прямо пропорционален молекулярной массе белковой
фракции.
8.1.5 Процессзавершен, когда нижние низкомолекулярные белковые фракции оказываются при мерно
в 2 см от нижнего края геля. Камеру отключают от источника тока и электродный буфер сливают.
Камеру разбирают и извлекают гель на поверхность стекла. Отделенный гель помещают в 12,5 %-ный
раствортрихлоруксуснойкислоты, выдерживают 15мин. сливаюткислотуи промываютдистиллирован
ной водой. Гель переносят в окрашивающий раствор и выдерживают при комнатной температуре в
течение 30 мин.
Затем опять промывают дистиллированной водой 2 раза. Обесцвечивание геля проводят в обес
цвечивающем растворе втечение 3 ч.
В результате получают полиакриламидный гель, в котором видны окрашенные в синий цвет поло
сы фракций анализируемого белка и полосы, соответствующие маркерным белкам сизвестной молеку
лярной массой. Сравнение белковых полос анализируемого образца с полосами маркерных белков
позволяет сделать заключение о фракционном составе определяемого белка и молекулярной массе
каждой фракции, а также выявить характеристические полосы белка, соответствующие примесям рас
тительного происхождения.
8.1.6 Повторяютанализ со второй параллельной пробой.
8.2 Определение массовой доли соевых белков
8.2.1 По градуировочному графику определяют массовую долю соевых белков в анализируемой
пробе.
9 Обработка результатов
9.1 За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение двух
параллельныхопределений, если выполняетсяусловие приемлемости:
г
((2.|С1-С 2|У(С1+ С2)]-100£ ож.(1)
6