С. 4 ГОСТ 29267-91
:
.
Одну таблетку перекиси водорода растворяют в 20 см3дистиллированной воды. К 10 см’ раствора
добавляют 0,05 см3раствора перекиси водорода.
2.5.1.5. Сок или измельченную ткань разводят буфером для проб и конъюгата в соотношении
110
2.5.2. Проведение анализа
Наливают по 0.1 см3рабочего раствора антител в лунки платы, накрывают ее крышкой и инку
бируют втечение 15- 16 ч при температуре 4 “С или 2 ч при температуре 37 ’С в термостате.
Удаляют раствор из платы резких* переворачиванием или вытряхиванием.
Трижды промывают лунки промывочным буфером.
Тщательно удаляют раствор из лунок легкими ударами перевернутой платой по листу фильтро
вальной бумаги.
Влунки платы наносят по 0,1 см3жидкости: в одну из лунок вносят «отрицательный* контроль,
вдругую «положительный*, иостальные - разведенный буферный экстракт анализируемых проб.
Накрывают плату крышкой и инкубируют I ч при 37 *С.
Лунки промывают промывочным буфером трижды.
Нативают 0,1 см ’ рабочего раствора конъюгата в лунки платы, накрывают крышкой и инкубиру
ют 1ч при 37 *С.
Лунки промывают промывочным буфером пять раз.
Наливают по 0,1 см3субстрата в лунки и инкубируют при комнатной температуре в течение
5—10 мин для развития окраски, после чего реакцию останаативают добавлением влунки по 0,50 см ’
трехмолярного раствора серной кислоты.
Наличие вирусной или бактериатьной инфекции определяют по интенсивности окрашивания в
лунках плате помощью фотометра при длине волны 490 нм или визуально.
2.5.3. Обработка результатов
2.5.3.1. При фотометрической оценке получают числовые значения оптической плотности (Лт )
окрашенного продукта ферментативной реакции в оптических единицах (О.Е). Порог достоверности
положительных результатов (Р) вычисляют по формуле
Р = X + 3Ь\
где х - среднее значение Л,*, отрицательного контроля (здоровый материал);
3£ - тройное значение максиматьного отклонения AiWот среднего вотрицательном контроле.
Все значения Л4Ч0выше значения порога достоверности положительных результатов (/’) считают
положительными результатами.
2.5.3.2. При визуальной оценке, даюшей информацию «да* или «нет*, применяют следующую
шкалу:
вирус отсутствует - едва заметное окрашивание (как в отрицательном контроле);
материал заражен —слабое, но заметное окрашивание, отличное от отрицательного контроля;
материал сильно заражен - интенсивное окрашивание, как в положительном контроле, или
более интенсивное.
2.5.4. Иммуноферментный анализ тепличных и полевых растений картофеля проводят во время
бутонизации или в начале цветения, пробирочных —в фазе 4 -5 междоузлий, клубней —перед реали
зацией.
2.6. Вороночный метод
Отобранные клубни тщательно моют в воде.
Анализируемую часть клубня измельчают ножом на мелкие кусочки размером 4—5 мм и кладут
на капроновую ткань, марлю (три слоя) или в молочные фильтры.
На конец воронки надевают резиновую трубку, к другому концу которой прикрепляют пробир
ку и устанавливают в штатив.
Воронку заполняют водой, нагретой до 25—30 "С (не доливая 1см до края).
В воронку с водой осторожно погружают капроновую сетку с кусочками клубня и оставляют на
4 -5 ч.
Отсоединяют пробирку, осторожно выливают воду, а осадок переносят на предметное стекло.
Осадок из Пробирки просматривают под бинокуляром или микроскопом.
При возникновении сомнений в отношении диагностики стеблевой нематоды осадок подкраши
вают 0,25-1 %-ным раствором метиленовой синьки. В этом растворе все сапробиотические нематоды
через 10—15 мин окрашиваются в синий цвет. Фитогельминты, в том числе и стеблевая
нематода картофеля, не окрашиваются.
82