ГОСТ 32648—2014
4.1.2 Тестируемое вещество
Исследуемое вещество растворяют в воде. Нерастворимые в воде вещества можно растворять
или суспендировать в подходящих растворителях (например, смеси этанола и Tween-бО или Tween-
80). а затем перед введением разводят в воде или физиологическом растворе. Следует избегать
использования диметилсульфоксида в качестве растворителя.
4.2 Условия тестирования
4.2.1 Пути введения исследуемого вещества
Возможно введение оральное, инъекционное или ингаляционное с газом или парами.
Кормление с исследуемым веществом может быть проведено с помощью раствора сахара. При
необходимости вещество можно растворить в 0.7 %-ном растворе NaCI и инъецировать в грудную
клетку или живот подопытного животного.
4.2.2 Уровни экспозиции
В начале оценки мутагенности применяют одну экспозицию исследуемого вещества, которая
является максимально переносимой концентрации или вызывает ряд признаков токсичности. Если
метод применяют для верификации, то проводят, по крайней мере, два дополнительных уровня
экспозиции.
4.2.3 Контроли
Необходимо включать негативный контроль с растворителем. Однако, если в лаборатории
накоплен большой исторический контроль, то нет необходимости ставить конкурентные контроли.
4.3 Проведение эксперимента
Самцов дикого типа (в возрасте 3-5 дней) обрабатывают исследуемым веществом и
скрещивают индивидуально с избытком виргинных самок линии Muller-5 или самками других,
соответственно маркированных (с множественными инверсиями Х-хромосомы) линий. Каждые 2-3
дня самок заменяют на новых виргинных самок, проводя таким образом анализ полного цикла
половых клеток. Потомство этих самок позволяет учитывать летальные эффекты при воздействии на
зрелую сперму, сперматиды на средней и поздней стадии, ранние слерматиды. сперматоциты и
сперматогонии.
Гетерозиготных самок (F1) предыдущих скрещиваний индивидуально (одна самка на пробирку)
спаривают с их братьями.В F2 генерации в каждой культуре определяют отсутствие самцов дикого
типа. Если F1 самка несет летальную Х-хромосому отца (т.е. наблюдается отсутствие самцов с
обработанной хромосомой), дочерей этих самок с тем же генотипом следует исследовать, чтобы
оценить передается ли летальность следующим генерациям.
Для теста должна быть заранее установлена чувствительность и сила. Число особей в каждой
группе должно определяться этими параметрами. Спонтанная частота мутантов, наблюдаемая в
соответствующем контроле, сильно влияет на число обработанных хромосом, которое необходимо
проанализировать, чтобы выявить вещества, индуцирующие частоту мутаций, близкую к таковой в
контроле.
Результаты теста должны быть подтверждены в отдельном эксперименте.
5 Результаты и отчет
5.1 Обработка результатов
Данные следует представлять в табличной форме, указывая число тестируемых хромосом,
число нефертильных самок, число летальных хромосом для каждой концентрации вещества, каждого
периода скрещивания на каждого обработанного самца. Следует представить число кластеров
разных размеров на самца.
Для оценки сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций применяют различные
статистические методы. Кластеры рецессивных леталей от одного самца следует учитывать и
оценивать соответствующими статистическими приемами.
5.2 Оценка результатов
Существуют разные критерии определения позитивного результата, один из которых -
статистически значимое повышение частоты сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций с
возрастанием дозы. Другой критерий - воспроизводимый, статистически значимый положительный
эффект хотя бы на одной экспериментальной точке.
Вещество, не вызывающее ни статистически значимого повышения частоты сцепленных с
полом рецессивных летальных мутаций с возрастанием дозы, ни статистически значимого
2